Η επίδραση του ισχαιμικού preconditioning στους μηχανισμούς βλάβης του νωτιαίου μυελού μετά από αποκλεισμό της κατιούσας θωρακικής αορτής σε χοίρους

Abstract

Purpose: Herein, we investigate a possible protective role of the basal levels of Hsp70, the relationship between β-catenin and Hsp70, and the possible activation of β-catenin signal pathway in an early IPC experimental model, suggesting a possible role of these proteins in “first window of protection”. Methods:A total of 42 market pigs were used. Twelve animals were used in experiments for neurological evaluation and were randomly assigned to 2 groups. The remaining 30 animals were used in experiments for biological measurements and innunohistochemical studies, and were randomly assigned to 5 groups. The aortic occlusion was accomplished intravascularly with two occlusion-balloon catheters under fluoroscopic guidance. Neurologic evaluation was performed by an independent observer according to Tarlov scale. After sacrifice the lumbar spinal cords were harvested. Immunoprecipitation and western blotting studies for Hsp70, cytoskeleton elements and β-catenin, were performed in order to study their relationship and possible modifications of this in early IPC, whereas with immunohistochemical studies we investigated the cellular distribution of Hsp70 and β-catenin. Results: According to neurologic evaluation, at 24 hours, spastic paraplegia with no or slight movement of the lower limbs was observed in 84% of animals in group A, whereas an equivalent percent of animals in group B had no neurologic deficits. The differences seen in neurologic outcome between the groups A and B were statistically significant (P=0.003). The biological measurements demonstrated that Hsp70 binds to actin and to intermediate filaments of neurons (neurofilaments) and that early ischemic preconditioning influenced significantly (P =0,025) only the binding profile of Hsp70 with neurofilaments, by increasing the amount of neurofilaments that binds to Hsp70. Additionally, with immunohistochemical studies, we observed immunoreactivity of Hsp70 in cytoplasm in groups 1 and 5 and translocation of Hsp70 in nucleus in groups 2, 3 and 4. As regard β-catenin there was an increase in the samples of group 3 and a weak binding relationship with Hsp70 wich was not influenced by IPC. The immunohistochemical studies shwoed immunoreactivity for β-catenin in cytoplasm and in nucleus only in group 3. Conclusions: The results indicate that Hsp70 has an essential role in early ischemic preconditioning of spinal cord, by a) protecting the intermediate filaments of neurons (neurofilaments) that have crucial function in axonal transport, nerve conduction and in cytoskeleton stabilization and b) ensuring the functionality and the integrity of the nucleus, as contribute in the protection and repair of its structures as soon as the intensive insult begin. Moreover IPC activated the β-catenin dependent signal pathway, the active/stabilized fraction of which can offer protection through various kinases.

Στόχος: Στην παρούσα μελέτη ερευνάμε τον πιθανό προστατευτικό ρόλο των βασικών επιπέδων της Hsp70 στον νωτιαίο μυελό, την σχέση σύνδεσης της β-κατενίνης με την Hsp70 αλλά και την πιθανή ενεργοποίηση του σηματοδοτικού μονοπατιού της β-κατενίνης στα πλαίσια ενός μοντέλου πρώιμου ισχαιμικού preconditioning. Μεθοδολογία: Χρησιμοποιήθηκαν συνολικά 42 χοίροι. Δώδεκα από αυτούς χρησιμοποιήθηκαν για νευρολογική αξιολόγηση και χωρίστηκαν τυχαία σε δύο ομάδες.Οι υπόλοιποι 30 χοίροι χρησιμοποιήθηκαν σε πειράματα για βιολογικές μετρήσεις και χωρίστηκαν τυχαία σε 5 ομάδες. Ο αορτικός αποκλεισμός πραγματοποιήθηκε ενδαγγειακά με χρήση ειδικών καθετήρων-μπαλονιών υπό ακτινοσκοπικό έλεγχο. Η νευρολογική εκτίμηση των πειραματόζωων έγινε από ανεξάρτητο παρατηρητή με βάση την κλίμακα Tarlov. Μετά τη θανάτωση ελήφθησαν ιστοτεμάχια της οσφυϊκής μοίρας του νωτιαίου μυελού τα οποία χρησιμοποιήθηκαν για τις βιολογικές μετρήσεις. Με τις τεχνικές της ανοσοκαθίζησης και της ανοσοαποτύπωσης μελετήθηκε η σχέση της Hsp70 με δομές του κυτταροσκελετού και την β-κατενίνη καθώς επίσης και η πιθανή διαφοροποίηση των σχέσεων αυτών στα πλαίσια του πρώιμου ισχαιμικού preconditioning, ενώ με ανοσοιστοχημικές μελέτες διερευνήθηκε η ενδοκυττάρια κατανομή της Hsp70 και της β-κατενίνης. Αποτελέσματα: Από την νευρολογική αξιολόγηση προέκυψε ότι στις 24 ώρες το 84% των πειραματόζωων στο group A εμφάνισαν σπαστική παραπληγία παρουσιάζοντας ή όχι κάποια κινητικότητα στα κάτω άκρα, ενώ ένα αντίστοιχο ποσοστό στο group B είχε φυσιολογική κινητικότητα. Οι διαφορές που παρατηρήθηκαν κατά την κλινική αξιολόγηση μεταξύ των ομάδων Α και Β ήταν στατιστικώς σημαντικές με P= 0,003. Οι βιολογικές μετρήσεις έδειξαν ότι η Hsp70 συνδέεται με την ακτίνη και τα ενδιάμεσα ινίδια των νευρικών κυττάρων (νευρονημάτια) σε όλες τις ομάδες, και ότι το πρώιμο ισχαιμικό preconditioning επηρέασε σημαντικά (P =0,025) μόνο τη σχέση της Hsp70 με τα νευρονημάτια αυξάνοντας την ποσότητα των τελευταίων που συνδέεται με την Hsp70. Επιπλέον, με ανοσοιστοχημικές μελέτες αποτυπώθηκε κυτταροπλασματική ανοσοδραστικότητα της Hsp70 στις ομάδες 1 και 5, και μετακίνησή της στον πυρήνα στις ομάδες 2,3 και 4. Όσον αφορά την β-κατενίνη παρατηρήθηκε αύξηση των επιπέδων της στην ομάδα 3 και μια ασθενής σχέση σύνδεσης με την Hsp70 η οποία όμως δεν επιρρεάστηκε από το IPC. Οι ανοσοιστοχημικές μελέτες έδειξαν ανοσοδραστικότητα της β-κατενίνης στο κυτταρόπλασμα και τον πυρήνα στα δείγματα της ομάδας 3. Συμπεράσματα: Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της παρούσας έρευνας η Hsp70 συμμετέχει στο μηχανισμό του πρώιμου ισχαιμικού preconditioning στο νωτιαίο μυελό, α) προστατεύοντας τα ενδιάμεσα ινίδια του νευρικού κυττάρου (νευρονημάτια) τα οποία συμβάλουν στη μετάδοση των νευρικών ερεθισμάτων, στην μηχανική υποστήριξη και στην σταθερότητα του κυτταροσκελετού, και β) συμμετέχοντας στην εξασφάλιση της λειτουργικότητας και της ακεραιότητας του πυρήνα , καθώς αρχίζει να δρα προστατευτικά και επισκευαστικά στις δομές του με την έναρξη του ισχαιμικού ερεθίσματος. Επιπλέον στα πλαίσια του πρώιμου IPC ενεργοποιείται ο μηχανισμός σταθεροποίησης της β-κατενίνης, το ενεργοποιημένο κλάσμα της οποίας φαίνεται ότι μπορεί να δράσει κυτταροπροστατευτικά μέσω διαφόρων κινασών.