Βιοχημική και ανοσολογική μελέτη της δράσης των αυξητικών παραγόντων στη βιοσύνθεση εκκρινόμενων Chondroitin και Dermatan sulfate πρωτεογλυκανών σε κυτταρικές σειρές μελανώματος και φυσιολογικών μελανοκυττάρων

Abstract

Melanoma is a frequent and therapy resistant human malignancy with a rising incidence rate, worldwide (Houghton et al., 2002). Malignant melanoma arises in the epidermis either in situ or in an invasive form, progressing from radial growth phase to vertical growth phase through enhanced invasion into the dermis (Lever, 2005). With malignant progression tumor cells partly through autocrine and paracrine production of growth factors and cytokines actively modulate their microenvironment in a tumor-favourable way to enable successful invasion (Selvamurugan et al., 2002; Hakamori et al., 2002; Nikitovic et al., 2006). The dermis extracellular matrix (ECM) consists of different types of collagens, glycoproteins, hyaluronan (HA) and proteoglycans (PGs) (Wang et al., 2003). Members of the small leucine-rich proteoglycans (SLRPs) family were found to participate in both the structural and the functional organization of the skin (Wang et al., 2003; Carrino et al., 2000). Previously it was shown that the SLRP lumican significantly affects the mechanical properties of the skin and that the lack of its expression results in skin fragility and laxity (Carrino et al., 2000; Vuillermoz et al., 2005). The role of lumican has been investigated in the growth and metastasis of several cancers, without being fully elucidated (Naito, 2005). Specifically it was demonstrated that human colorectal cancer cells (Lu et al., 2002), cervical squamous carcinoma cells (Naito, 2002) and pancreatic adenocarcinoma cells express lumican mRNA and different glycosylated types of its protein (Lu, 2002). In contrast, lumican in breast cancer tissues is expressed in fibroblasts adjacent to cancer cells but not in cancer cells (Leygue et al., 1998). Furthermore, it has been demonstrated that reduced expression of lumican is associated with poor outcome in node-negative invasive 6 breast cancer (Troup et al., 2003) while high expression level of lumican is associated with a high pathological tumor grade, low estrogen receptor levels in the cancer tissue, and younger age of patients (Leygue et al., 1998). Pancreatic myofibroblasts of the tumor stroma were also found to strongly overexpress lumican (Koninger et al., 2004). An in vitro/in vivo study showed that lumican expression by transfected B16F1 mouse melanoma cells resulted in inhibition of hypodermal melanoma growth in syngenic mice, but failed to change the B16F1 cell differentiation, growth rate and adhesion properties (Vuillermoz et al2004). The above reports suggest that lumican may have a role both in the host reaction of the peritumoral cells as well as in tumor growth. The expression of lumican by human melanoma cells has not, to our knowledge, been reported. The aim of the present study was to investigate and to characterize lumican expression at the mRNA, protein and carbohydrate level, in two human malignant melanoma cell lines (WM9 and M5) and normal neonatal human melanocytes (HEMN). Both human metastatic melanoma cell lines were found to express lumican mRNA and effectively secrete lumican in a proteoglycan (PGs) form, characterized to be substituted mostly with keratan sulfate chains. Lumican mRNA was not detected in normal melanocytes. This is the first time that the synthesis and secretion of lumican in human melanoma cell lines is reported. The role of this proteoglycan in the development and progression of malignant melanoma has to be further investigated. The members of the fibroblast growth factor (FGF) family (Eswarakumar, Lax, & Schlessinger, 2005) function through four distinct, high-affinity cell surface receptors with intrinsic tyrosine kinase activity, designated FGFR1–4 (Basilico & Moscatelli, 1992). The binding of FGFs to the extracellular ligand domain of FGFRs induces receptor dimerization, activation and autophosphorylation of multiple 7 tyrosine residues in the cytoplasmic domain of the receptor molecule (Jaye, Schlessinger, & Dionne, 1992), leading to the stimulation of intracellular signaling pathways that control cell proliferation, differentiation, migration or survival (Eswarakumar et al., 2005). Human melanomas most uniformly constitutively express basic fibroblast growth factor (FGF-2). As these cancer cells simultaneously express FGFRs their growth is stimulated by FGF-2 in an autocrine manner (Rodeck, 1993; Rodeck et al., 1991; Yeoman, 1993). The biological significance of this autocrine loop has been demonstrated using anti-sense oligonucleotides that targeted FGF-2 or by inactivating FGF-2 with anti-FGF-2 antibodies resulting in an inhibition of melanoma cell proliferation both in vitro and in vivo (Beckcer, Meier, & Herlyn 1989; Rofstad & Halsor, 2000; Wang & Becker, 1997). On the other hand, increased expression of FGF-2 stimulates the transformed melanoma phenotype demonstrating that FGF-2-dependent signaling is essential in melanoma tumor progression (Meier et al., 2000)...

Το κακόηθες μελάνωμα έχει προσελκύσει το πραγματικό ενδιαφέρον τα τελευταία χρόνια λόγω της αυξημένης συχνότητάς του. Η συχνότητα εμφάνισής του έχει εκτιμηθεί ότι διπλασιάζεται παγκοσμίως κάθε 10-15 χρόνια και ο κίνδυνος στη διάρκεια της ζωής είναι μεταξύ 0,5-1,0 %. Προσβάλλει κυρίως ανθρώπους με λευκό δέρμα και η έκθεση στην υπεριώδη ακτινοβολία είναι ένας ουσιαστικός παράγοντας για την ανάπτυξή του, η δε σχέση μεταξύ κινδύνου και έκθεσης είναι ασαφής. Το κακόηθες μελάνωμα είναι η πιο σοβαρή δερματική κακοήθεια και η πρόγνωση μερικών όγκων παραμένει πολύ πτωχή. Το πάχος κατά Breslow, δηλαδή το κατακόρυφο πάχος του όγκου από την κοκκώδη στιβάδα της επιδερμίδας στη βαθύτερη περιοχή του μελανώματος, είναι ο πιο σημαντικός προγνωστικός παράγον. Γενικά, οι ασθενείς με λεπτούς όγκους έχουν πολύ μεγαλύτερη επιβίωση από εκείνους με παχύς βλάβες, το δε ποσοστό της 5ετούς επιβίωσης για αλλοιώσεις μικρότερες από 1,5 mm πάχους είναι 93 %, συγκρινόμενο με το 73% για εκείνες με 1,5-3, 49 mm πάχους, και το 48 % για εκείνες των 3,5 mm ή και περισσότερο. Οι πρωτεογλυκάνες (proteoglycans, PGs) είναι μια από τις κύριες κατηγορίες γλυκοσυζευγμάτων (glycoconjugates) που συναντώνται σε όλους τους ιστούς. Εντοπίζονται κυρίως στον εξωκυττάριο χώρο, αλλά και σε κυτταρικό επίπεδο (μεμβράνη και εκκριτικά ενδοκυτταρικά κοκκία). Συμμετέχουν στη ρύθμιση σημαντικών κυτταρικών γεγονότων όπως, κυτταρική προσκόλληση, μετακίνηση, διαφοροποίηση και πολλαπλασιασμός. Συμμετέχουν επίσης στην οργάνωση του εξωκυττάριου χώρου μέσω των αλληλεπιδράσεών τους με σημαντικά μακρομόρια όπως το κολλαγόνο, οι λιποπρωτεΐνες, οι αυξητικοί παράγοντες και οι υποδοχείς αυξητικών παραγόντων. Οι PGs αποτελούνται από έναν πρωτεϊνικό κορμό πάνω στον οποίο συνδέονται ομοιοπολικά αλυσίδες γλυκοζαμινογλυκανών (glycosaminoglycans, GAGs) και ολιγοσακχαριτών. Τόσο ο πρωτεϊνικός κορμός όσο και οι υδατανθρακικές αλυσίδες προσδίδουν στις πρωτεογλυκάνες μοναδικές βιολογικές και φυσικοχημικές ιδιότητες. Η τάση του φυσιολογικού δέρματος προς διατήρηση της σταθερότητας των στοιχείων του υποστηρίζεται από τη δυναμική αλληλεπίδραση μεταξύ των μελανοκυττάρων και του μικροπεριβάλλοντός τους όπως είναι τα κερατινοκύτταρα, οι ινοβλάστες, τα κύτταρα του ανοσολογικού συστήματος και η εξωκυττάριος 1 θεμέλια ουσία. Τα μελανοκύτταρα προσφύονται στα κερατινοκύτταρα ενώ η επικοινωνία μεταξύ μελανοκυττάρων και ινοβλαστών ή ενδοθηλιακών κυττάρων πραγματοποιείται μέσω διαλυτών παραγόντων. Στην πορεία του μετασχηματισμού και της εξέλιξης των μελανοκυττάρων και των κυττάρων του μελανώματος, υπάρχουν αλληλεπιδράσεις μεταξύ των νεοπλασματικών κυττάρων και των παρακείμενων φυσιολογικών κυττάρων του δέρματος, όπως είναι τα κύτταρα της δερμίδας και τα ενδοθηλιακά κύτταρα. Αυτοκρινείς αυξητικοί παράγοντες όπως ο bFGF που παράγεται από τα κύτταρα του μελανώματος διεγείρει τον πολλαπλασιασμό των ίδιων των αρχέγονων κυττάρων και παρακρινείς αυξητικοί παράγοντες όπως ο PDGF και ο VEGF ρυθμίζουν το μικροπεριβάλλον προάγοντας την ανάπτυξη του όγκου και την διήθηση. Οι παρακρινικές επιδράσεις περιλαμβάνουν τον πολλαπλασιασμό των ινοβλαστών και την ινοπλασία (δεσμοπλασία), την αγγειογέννεση και την φλεγμονή. Έχει αναφερθεί ότι η παραγωγή αυξητικών παραγόντων από τα κύτταρα του μελανώματος είναι η κινητήριος δύναμη για την εξέλιξη του ακτινωτού (RGP) σε κατακόρυφο (VGP) μελάνωμα διότι ελέγχουν εκτός από την ανάπτυξη του όγκου και τον σχηματισμό του στρώματος. Η ανάπτυξη του καρκίνου ως εξέλιξη με πολλά βήματα χρειάζεται μεταξύ των άλλων και επιπλέον μελέτες για τον χαρακτηρισμό της ανάμειξης των διαφόρων πρωτεογλυκανών σε κάθε βήμα των νεοπλασιών. Καθορισμός του ρόλου της κάθε πρωτεογλυκάνης και ξεχωριστά των εκκρινόμενων ή/και των συνδεδεμένων με την κυτταρική μεμβράνη πρωτεογλυκανών στους παθολογικούς μηχανισμούς. Η πληρέστερη ανάλυση της δομής των γλυκοζαμινογλυκανικών αλυσίδων πρέπει επίσης να συσχετίζεται με την παθολογική ανατομική. Πιστεύεται, ότι η γνώση της δομής και του ρόλου ειδικών πρωτεογλυκανών θα προσφέρει μηχανισμούς δράσης που θα βοηθήσουν την θεραπεία του καρκίνου....