Investigation of pathogenesis, clinical course, prognosis and response to therapy of systemic lupus erythematosus: perspective and comparative study using DNA microarrays in bone marrow and peripheral blood samples

Abstract

Σκοπός: Στην παρούσα ερευνητική μελέτη διερευνήθηκε η δυνατότητα καθορισμού της αιτιοπαθογένειας, πρόγνωσης, της πορείας της νόσου και της ανταπόκρισης στην θεραπεία κατά την έναρξή της επί τη βάσει της έκφρασης γονιδίων σε ιστούς όπως ο μυελός των οστών και το περιφερικό αίμα. Οι ιστοί αυτοί εμπεριέχουν κύτταρα τα οποία συμμετέχουν στην παθογένεια της νόσου (μονοπύρηνα/μακροφάγα, Β και Τ λεμφοκύτταρα, ΝΚ κύτταρα και ουδετερόφιλα). Η συλλογή δειγμάτων αποτελείται από ασθενείς με ΣΕΛ και υγιείς μάρτυρες από τους οποίους έγινε λήψη περιφερικού αίματος και μυελού των οστών. Ασθενείς και Μέθοδοι Κατά τη διάρκεια των εργασιών χρησιμοποίηθηκαν 27 ασθενείς με Συστηματικό Ερυθηματώδη Λύκο και φυσιολογικοί μάρτυρες. όπου έγινε η απομόνωση RNA από τα κύτταρα του περιφερικού αίματος και του μυελού των οστών. Μετά τον έλεγχο του RNA ο αριθμός των δειγμάτων που χρησιμοποιήθηκαν στις μικροσυστοιχίες είναι 27 δείγματα περιφερικού αίματος και 22 μυελού των οστών από ασθενείς με ΣΕΛ και 6 δείγματα περιφερικού αίματος και 10 μυελού των οστών από φυσιολογικούς μάρτυρες.Εν συνεχεία χρησιμοποιήθηκαν 2μg ολικού RNA για την σύνθεση cDNA και την περαιτέρω σήμανση του με Cy χρώση. Τα δείγματα υβριδοποιήθηκαν σε πίνακες (glass slides) που αντιπροσωπεύουν 21,329 γονίδια και η ανάλυσή τους έγινε μετά από σάρωση σε Agilent DNA microarray scanner. Για την στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων χρησιμοποιήθηκαν 4 ομάδες για τον καθορισμό της έκφρασης των γονιδίων, κρίνοντας στατιστικά σημαντικές τις διαφορές της έκφρασης των γονιδίων μεγαλύτερες από 2-fold. Στην πρώτη ανάλυση πραγματοποιήθηκε σύγκριση των εκφραζομενων γονιδίων μεταξύ των δειγμάτων του φυσιολογικού μυελού των οστών και των ασθενών με ΣΕΛ. Στη δεύτερη ανάλυση έγινε σύγκριση μεταξύ των δειγμάτων του περιφερικού αίματος των μαρτύρων και των ασθενών με λύκο. Η τρίτη ανάλυση αφορά στην ομάδα των ασθενών και πραγματοποιήθηκε συγκριτική ανάλυση μεταξύ του περιφερικού αίματος και του μυελού των οστών. Επίσης έγινε η ανάλυση 22 κυτταροκινών στον ορό ασθενών με ΣΕΛ και η σύγκρισή τους με υγιείς. Οι κυτταροκίνες που εκτιμήθηκαν ήταν IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, CXCL8 (IL-8), IL-10, IL-12 (p40), IL-13, IL-15, IL-17, IL-1Ra, IP-10 interferon (IFN)-α και IFN-γ, TNF-α, GM-CSF, CCL2, MCP-1/(MCAF), CCL3 , MIP-1α, CCL4 (MIP-1β) και CCL11 Αποτελέσματα Μετά από την στατιστική ανάλυση (unpaired student’s t-test, 5% false discovery rate) προέκυψαν 103 διαφορετικά εκφραζόμενα γονίδια στον μυελό των οστών μεταξύ των ασθενών και των υγιών μαρτύρων τα οποία αντιπροσωπεύουν διάφορους μηχανισμούς δράσης. 54 εκ των 103 γονιδίων ενέχονται σε 4 μεγάλα δίκτυα που περιλαμβάνουν κυτταρικό θάνατο, καρκίνο, κυτταρική ανάπτυξη και πολλαπλασιασμό καθώς και διάφορα σηματοδοτικά μονοπάτια. Ακολούθησε ιεραρχική ομαδοποίηση (hierarchical clustering) των δειγμάτων του μυελού των οστών –και του περιφερικού αίματος- βάσει της ομοιότητας του προτύπου της γονιδιακής έκφρασης και παρατηρήθηκε ότι οι ανενεργοί ασθενείς στον μυελό ομαδοποιήθηκαν διαφορετικά από τους ενεργούς βάσει 2652 γονιδίων με υψηλή έκφραση. Στον μυελό των οστών των ενεργών ασθενών παρατηρήθηκε υψηλή έκφραση γονιδίων σχετιζόμενα με τον κυτταρικό θάνατο και με την κοκκιοποίηση. Επίσης τα γονίδια που εμπλέκονται στην κοκκιοποίηση παρουσίασαν υψηλή συσχέτιση με την ενεργότητα του λύκου (SLEDAI) στο μυελό των οστων (r = 0.55, p = 0.0259). Στη συγκριτική ανάλυση του μυελού των οστών με το περιφερικό αίμα προέκυψαν 88 γονίδια, 61 εκ των οποίων εμπλέκονται σε μηχανισμούς όπως ο καρκίνος, κυτταρική κίνηση και μορφολογία, ανοσολογική απάντηση καθώς και σε μηχανισμούς λειτουργίας του αιμοποιητικού συστήματος. Στον ορό των ασθενών με ΣΕΛ , έξι κυτταροκίνες ήταν αυξημένες σε σχέση με τους υγιείς μάρτυρες : IL-1Ra, IP-10, IL-8, TNF-α, IL-15, και MCP-1. Καμια από τις κυτταροκίνες της χυμικής ανοσίας δεν ήταν ιδιαιτερα αυξημένη στον ορό των ασθενών. Συμπέρασμα Η ανάλυση των δειγματων μυελού των οστών ασθενών με ΣΕΛ, με μικροσυστοιχίες διαχώρισε καλύτερα τους ασθενείς με ΣΕΛ βάσει της ενεργότητας της νόσου και αποκάλυψε ομάδες γονιδίων σχετιζόμενα με την απόπτωση και την κοκκιοποίηση, υπογραμμίζοντας την σπουδαιότητά τους στην παθογένεια της νόσου. Επίσης η αυξημένη έκφραση κυτταροκινών TNF-α και IL15, στον ορό ασθενών με ΣΕΛ, συνιστούν την επικράτηση της Th1-εξαρτώμενης ανοσολογικής απόκρισης.