Μηχανισμοί μεταγραφικής ρύθμισης των γονιδίων των απoλιποπρωτεϊνών του ανθρώπου in vivo

Abstract

Numerous epidemiological and clinical trials have established that High Density Lipoprotein (HDL) is a strong and independent risk factor for the development of atherosclerosis and Coronary heart disease (CHD) which is the leading cause of morbidity and mortality in Western countries. These studies showed that there is an inverse correlation between plasma HDL cholesterol levels and incidence of acute cardiovascular events. On the other hand, it has been well documented in recent years that the concentration of plasma HDL is not by itself a good biomarker for CHD risk prediction but the functionality of HDL particles is also important. HDL has multiple atheroprotective functions which include the removal of excess cholesterol from peripheral cells and protective functions on the vascular endothelium. These functions are disturbed in subjects with mutations in key genes of the HDL biogenesis/maturation pathway as well as in patients with chronic inflammatory diseases. HDL levels are regulated by genetic and environmental factors as well as by drugs. Existing drugs raise HDL levels to a minor extent suggesting that novel strategies are needed. In the present study, we investigated in detail the molecular mechanisms that control the expression of genes which are involved in lipoprotein metabolism. More specifically: In Parts I and II, we explored the mechanisms that regulate the expression of the gene encoding apolipoprotein M (apoM) in hepatic cells. ApoM is a recently described apolipoprotein that plays an essential role in HDL maturation in plasma. We analyzed the human apoM promoter and we identified a novel Hormone Response Element (HRE) that serves as a binding site for various members of the hormone nuclear receptor superfamily such as HNF-4 and heterodimers of Retinoid X Receptor (RXR) with receptors for oxysterols (LXR), thyroid hormone (TRβ1) and fibrates (PPAR). This element was further characterized by site directed mutagenesis and was found to mediate the response of the apoM promoter to the above agonists. In a region adjacent to this novel HRE, we identified and characterized a dual specificity regulatory element that binds HNF-1 and 3 members of the AP-1 family of transcription factors (c-Jun and JunB). Using in vitro and in vivo assays we established that activation of PKC by phosrbol esters leads to the activation of Jun proteins which bind to the dual specificity response element and displace HNF-1 leading to transcription repression. Based on these findings, we propose a model that could account for the downregulation of apoM gene expression during infection and inflammation. We also found that a similar mechanism could apply to a second HDL-related gene which encodes for apolipoprotein A-II. In Part III, we investigated the mechanism of downregulation of the gene endocing the ATP Binding Cassettee Transporter A1 (ABCA1) by inflammatory factors. Similar to ApoM, we found that the proximal ABCA1 promoter contains an AP-1 element that binds c-Jun. Activation of c-Jun by Protein Kinase C was found to inhibit ABCA1 promoter activity in hepatic cells. In Parts IV and V we focused on the role of miRNAs in the regulation of the expression of genes that are involved in lipoprotein metabolism. The focus was on the role of let-7b in the regulation of apoE gene expression in macrophages (Part IV) and on the role of miR-122 in the expression of several lipoprotein-related genes in hepatic cells (Part V). We found that the apoE gene, which plays several atheroprotective roles including the biogenesis of HDL, is a direct target of let-7b which binds to apoE 3’ UTR and downregulates its expression. The let-7b target site in apoE was verified by in vitro mutagenesis and functional assays. We also found that let-7b plays a role in the inhibition of apoE gene expression by lipopolysaccharide (LPS, model of bacterial infection) in macrophages. Finally, we found that overexpression of miR122 in hepatic cells was associated with a marked increase in the expression of genes that are involved in lipid metabolism including apoB, ABCA1 and Sterol regulatory Element Binding Proteins (SREBPs). Our findings are in line with previous overexpression and knockdown studies in mice which had shown a positive association between miR-122 expression levels and plasma cholesterol and triglyceride levels, hepatic cholesterol levels and lipid accumulation, as well as fatty acid and cholesterol synthesis. 4 In conclusion, understanding the mechanisms of HDL physiology and regulation is very important for developing novel strategies to increase HDL levels in plasma, to correct its functional abnormalities and to effectively treat patients with CHD

Επιδημιολογικές και κλινικές μελέτες έχουν δείξει ότι τα επίπεδα της λιποπρωτείνης υψηλής πυκνότητας (Ηigh Density Lipoprotein, ΗDL) αποτελούν ανεξάρτητο παράγοντα κινδύνου για την ανάπτυξη αθηροσκλήρωσης και στεφανιαίας νόσου η οποία αποτελεί την κύρια αιτία θνησιμοτητας στις ανεπτυγμένες βιομηχανικά χώρες. Από τις μελέτες αυτές προκύπτει μία αντίστροφη σχέση μεταξύ των επιπέδων της ΗDL στο πλάσμα και της εμφάνισης καρδιαγγειακών παθήσεων. Ωστόσο, τα ανεβασμένα επίπεδα της HDL δεν αρκούν για τη προστασία από τις καρδιαγγειακές παθήσεις διότι η λειτουργικότητα της HDL είναι εξίσου σημαντική. Η αντι- αθηρογενετική δράση της HDL οφείλεται στις πλειοτροπικές της ιδιότητες που περιλαμβάνουν την εκροή τηε περίσσειας χοληστερόλης από τα περιφερικά κύτταρα και τη διατήρηση της ακεραιότητας των ενδοθηλιακών κυττάρων. Αυτές οι δράσεις της ΗDL δεν λειτουργούν σωστά σε άτομα με μεταλλάξεις σε γονίδια που εμπλέκονται στη βιογένεση ή το μεταβολισμό της ΗDL καθώς και ασθενείς με χρόνια φλεγμονή. Τα επίπεδα της HDL στο πλάσμα καθορίζονται από γενετικούς και περιβαλλοντικούς παράγοντες καθώς επίσης και από φαρμακευτική αγωγή. Τα διαθέσιμα θεραπευτικά μέσα οδηγούν σε μικρή αύξηση των επιπέδων της HDL καθιστώντας αναγκαία την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών στρατηγικών. Ο σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η μελέτη των μοριακών μηχανισμών που ρυθμίζουν την έκφραση γονιδίων που συμμετεχουν στο μεταβολισμό των λιποπρωτεϊνών του ανθρώπου. Πιο συγκεκριμένα: Στις Ενότητες Ι και ΙΙ, μελετήσαμε τους μηχανισμούς που ρυθμίζουν την έκφραση του γονιδίου που κωδικοποιεί την απολιποπρωτεϊνη Μ (αpoΜ) στα ηπατικά κύτταρα. Η αpοΜ είναι μια σχετικά καινούργια απολιπο πρωτεΐνη που παίζει ουσιαστικό ρόλο στην ωρίμανση της HDL στο πλάσμα. Αναλύσαμε τον υποκινητή της αpoM του ανθρώπου και ταυτοποιήσαμε ένα καινούργιο στοιχείο απόκρισης σε στεροειδείς ορμόνες (Hormone Response Element, HRE) το οποίο αποτελεί θέση πρόσδεσης για πολλά μέλη της οικογένειας των πυρηνικών υποδοχέων ορμονών, όπως ο ΗΝF-4 και τα 6 ετεροδιμερή του υποδοχέα του 9-cis ρετινοϊκού οξέος (RXR) με τους πυρηνικούς υποδοχείς των οξυστερολών (LXR), της ορμόνης του θυρεοειδούς (ΤRβ1) και των φιμπρατών (PPAR). H μεταλλαξιγένεση αυτής της θέσης έδειξε ότι η περιοχή αυτή είναι υπεύθυνη για την την απόκριση του υποκινητή του γονιδίου της αποM στους συνδέτες για τους παραπάνω πυρηνικους υποδοχείς. Κοντά σ’αυτό το καινούργιο HRE, ταυτοποιήσαμε και χαρακτηρίσαμε ένα ρυθμιστικό στοιχείο πρόσδεσης τόσο του παράγοντα HNF-1 όσο και μελών της οικογένειας μεταγραφικών παραγόντων ΑΡ-1 (c- Jun και JunB). Χρησιμοποιώντας αναλύσεις in vitro και in vivo, δείξαμε ότι η ενεργοποίηση της πρωτεϊνικής κινάσης C (PKC) από τους εστέρες της φορβόλης (PMA) οδηγεί σε ενεργοποίηση των πρωτεϊνών Jun που προσδένονται σ΄αυτό το ρυθμιστικό στοιχείο εκτοπίζοντας τον HNF-1 με αποτέλεσμα την μεταγραφική καταστολή του γονιδίου της αpοΜ. Με βάση αυτά τα ευρήματα, προτείνουμε ένα μοντέλο για την αρνητική ρύθμιση της έκφρασης του γονιδίου της αποΜ κατά τη διάρκεια φλεγμονής. Ένας παρόμοιος μηχανισμός βρήκαμε να ισχύει για ένα άλλο γονίδιο που σχετίζεται με την HDL, το γονίδιο που κωδικοποιεί για την απολι πρωτεΐνη Α-ΙΙ. Στην Ενότητα ΙΙΙ, διερευνήσαμε το μηχανισμό αρνητικής ρύθμισης του γονιδίου που κωδικοποιεί τον μεμβρανικό μεταφορέα λιπιδίων ATP Binding Cassette Transporter A1 (ΑΒCA1) από παράγοντες φλεγμονής. Ομοίως με την αpoM, βρήκαμε ότι ο εγγύς υποκινητής του γονιδίου ABCA1 έχει ένα ρυθμιστικό στοιχείο ΑΡ-1 στο οποίο προσδένεται ο μεταγαφικός παράγοντας c-Jun. Ενεργοποίηση του c-Jun από την PKC καταστέλλει την ενεργότητα του υποκινητή του ΑΒCA1 σε ηπατικά κύτταρα. Τέλος, στις Ενότητες ΙV και V, μελετήσαμε στο ρόλο των miRNAs στη ρύθμιση της έκφρασης γονιδίων που συμμετέχουν στο μεταβολισμό των λιποπρωτεϊνών του ανθρώπου. Επικεντρωθήκαμε στο ρόλο του let-7b στη ρύθμιση της έκφρασης του γονιδίου της αποE στα μακροφάγα (Ενότητα ΙV) και στο ρόλο του miR-122 στη ρύθμιση της έκφρασης γονιδίων που εμπλέκονται στο μεταβολισμό των λιποπρωτεϊνών σε ηπατικά κύτταρα (Ενότητα V). Βρήκαμε ότι το γονίδιο που κωδικοποιεί για την αποE, η οποία έχει πολλαπλή αθηροπροταστευτική δράση, περιλαμβανομένης της βιογένεσης της ΗDL, αποτελεί άμεσο στόχο του let-7b το οποίο προσδένεται στο 3’UTR της apoE και 7 καταστέλλει την έκφρασή της. Η θέση πρόσδεσης του let-7b στην αποE επιβεβαιώθηκε με in vitro μεταλλαξιγένεση. Επιπλέον βρήκαμε ότι το let-7b παίζει ρόλο στην καταστολή της έκφρασης του γονιδίου της αποE από λιποπολυσαχαρίτες (LPS) στα μακροφάγα. ...