Συμβολή στη διερεύνηση των μοριακών μηχανισμών που καθορίζουν την ανοσολογική απόκριση κατά την πειραματική σπλαχνική λεϊσμανίωση

Abstract

Leishmania spp., an obligatory intracellular protozoan parasite, is the causative agent of visceral leishmaniasis (VL) which is a severe disease with various clinical signs. In the present study, we investigated for the first time MAP kinases (ERK1/2, p38 και JNK1/2) and NF-κΒ signal transduction pathways during infection with L. infantum. According to our findings, promastigotes were able to infect peritoneal macrophages inhibiting ERK1/2, p38 and JNK1/2 MAPK phosphorylation, IL-12, TNFα and ΝΟ production and CD40, CD80, CD86 and MHC-II molecules expression. In contrast, macrophage stimulation with soluble Leishmania antigen (SLA) triggered rapid ERK1/2 phosphorylation and dephosphorylation of p38 and JNK1/2 MAP kinases. Furthermore, LPS stimulation of cells during parasite phagocytosis resulted in reduced MAP kinase phosphorylation levels and reduced expression of IL-12, TNFα and ΝΟ, suggesting that infected macrophages have become refractory to secondary microbial stimuli during initial stage of infection. Preincubation with MAP kinase specific inhibitors suggested that the inhibition or the reduction of MAP kinase phosphorylation observed during infection played a role in the downregulation of the abovementioned molecules. Specifically, IL-12 production was positively regulated by p38 MAP kinase, NO production was positively regulated by p38 and JNK1/2 MAP kinases and TNFα production was positively regulated by all three MAP kinases. Furthermore, parasite infection abrogated NF-κΒ activation, but when infected macrophages were stimulated with LPS stimulation we detected ΙκΒα degradation. In contrast, even though dendritic cells (DCs) were able to phagocytose promastigotes, they did not enhance amastigotes survival. DC infection triggered ERK1/2 phosphorylation, and affected SOCS expression. ERK1/2 phosphorylation resulted in IL-10 production and was prerequisite for the suppression of IL-12 production. Also, promastigotes engulfment by immature DCs induced their differentiation into semimature DCs which was related with slight increase of costimulatory molecules expression (CD40, CD86 and MHC-II) and weak pro-inflammatory and inflammatory (TNFα and IL-12, respectively) cytokines production. These cells could prime allogenic T cell proliferation, but were unresponsive to CD40L binding, resulting to low levels of IL-12 and TNFα secretion. Similar results were observed after DC stimulation with SLA. On the contrary, exposure of IFN-γ-primed dendritic cells to SLA and CD40L resulted in enhancement of p38 MAP kinase phosphorylation, NF-κΒ activation and increased IL-12 and TNFα secretion. According to our findings, we could suggest that treatment with substances causing p38, JNK1/2 MAP kinases and NF-κΒ activation, such as IFN-γ or ERK1/2 inhibitors, which could enhance IL-12 and NO production, may result in parasite destruction.

Η λεϊσμανίωση αποτελεί μια ομάδα νοσημάτων, ποικίλης κλινικής συμπτωματολογίας, που προκαλούνται από τα πρωτόζωα παράσιτα του γένους Leishmania. Στόχος της παρούσας διατριβής ήταν η διερεύνηση και η μελέτη των μηχανισμών κυτταρικής σηματοδότησης (ΜΑΡ κινάσες: ERK1/2, p38 και JNK) που επηρεάζονται από το παράσιτο L. infantum κατά τη μόλυνση μακροφάγων ή δενδριτικών κυττάρων in vitro. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της έρευνας, το παράσιτο εγκαταστάθηκε επιτυχώς μέσα στα μακροφάγα χωρίς να διεγείρει την ενεργοποίηση των ERK1/2, p38 και JNK1/2 κινασών, την παραγωγή της IL-12, του TNFα και του NO και την έκφραση των μορίων CD40, CD80, CD86 και MHC-II. Αντίθετα, η επώαση των κυττάρων με διαλυτό αντιγόνο παρασίτου (SLA) προκάλεσε ταχεία και σύντομη φωσφορυλίωση των ERK1/2 κινασών και αποφωσφορυλίωση των αρχικών επιπέδων της p38 ΜΑΡ κινάσης. Διαπιστώθηκε ότι το παράσιτο κατά τη φαγοκυττάρωσή του παρεμπόδισε την απόκριση των μακροφάγων σε δευτερογενή ερεθίσματα (π.χ. LPS), σύμφωνα με τα μειωμένα επίπεδα ενεργοποίησης των ERK1/2, p38 και JNK κινασών. Η χρήση των ειδικών αναστολέων των ΜΑΡ κινασών απέδειξε ότι η παρεμπόδιση ή η μείωση της ενεργοποίησης των ΜΑΡ κινασών σχετιζόταν άμεσα με την αναστολή της παραγωγής των IL-12, TNFα και ΝΟ. Ειδικότερα, η p38 ΜΑΡ κινάση διαπιστώθηκε ότι ρυθμίζει θετικά την παραγωγή της IL-12 και του ΝΟ, η παραγωγή του ΝΟ ρυθμίζεται θετικά από τις JNK κινάσες, ενώ η παραγωγή του TNFα ρυθμίζεται και από τις τρεις ΜΑΡ κινάσες. Επιπλέον, το παράσιτο παρεμπόδισε την ενεργοποίηση του μεταγραφικού παράγοντα NF-κΒ, τα επίπεδα του οποίου επανήλθαν σε εκείνα των φυσιολογικών κυττάρων μετά την ενεργοποίηση τους με LPS. Σε ό,τι αφορά στα δενδριτικά κύτταρα, διαπιστώθηκε ότι μπορούσαν να προσλάβουν το παράσιτο, το οποίο προκάλεσε την ενεργοποίηση των ERK1/2 κινασών χωρίς, όμως, να αποτελούν ευνοϊκό περιβάλλον για την επιβίωσή του. Η ενεργοποίηση των ERK1/2 διέγειρε την παραγωγή της IL-10 και κατέστειλε την παραγωγή της IL-12. Επίσης, διαπιστώθηκε αλλαγή των επιπέδων έκφρασης των SOCS πρωτεϊνών. Τα δενδριτικά κύτταρα χαρακτηρίστηκαν ημιώριμα λόγω της αυξημένης έκφρασης των μορίων CD40, CD86 και MHC-II και των χαμηλών επιπέδων παραγωγής της IL-12 και του TNFα, αλλά μπορούσαν να διεγείρουν τον κλωνικό πολλαπλασιασμό αλλογενών Τ-λεμφοκυττάρων. Ωστόσο, δεν ενεργοποιούνταν περαιτέρω κατά την πρόσδεση του CD40L στο μόριο CD40 στην επιφάνειά τους, όπως επιβεβαιώθηκε από τα μειωμένα επίπεδα παραγωγής της IL-12 και του TNFα. Όμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν κατά την επώαση των δενδριτικών κυττάρων με SLA. Παρά ταύτα, η ενεργοποίηση τους με IFN-γ, πριν την έκθεσή τους στο SLA και το CD40L, προκάλεσε την ενεργοποίηση της p38 ΜΑΡ κινάσης και του NF-κΒ, καθώς και την αύξηση των επιπέδων παραγωγής της IL-12 και του TNFα. Σύμφωνα με τα παραπάνω αποτελέσματα, στο πλαίσιο της χημειοθεραπείας/ανοσοθεραπείας της λεϊσμανίωσης, είναι σκόπιμο να περιληφθεί η χορήγηση ουσιών (π.χ. IFN-γ ή χημικοί αναστολείς των ERK1/2 κινασών) που επάγουν την ενεργοποίηση των p38 και JNK κινασών και του μεταγραφικού παράγοντα NF-κΒ για την ενίσχυση της παραγωγής της IL-12 και του ΝΟ και κατά συνέπεια την ενίσχυση της ανοσολογικής απόκρισης του ξενιστή και την καταστροφή του παρασίτου