Ανοσοϊστοχημική μελέτη της έκφρασης των μεταλλοπρωτεϊνασών 1 και 3 (MMP-1 και MMP-3) και εντόπιση του m-RNA της MMP-3 σε καρκινώματα μαστού

Abstract

Metastasis, the spread of cancer from its primary site to a distant organ, is the main cause of death in patients with malignancy. An essential process in forming distant metastases is the degradation of the extracellular matrix allowing tumor cells to invade local tissue, intravasate and extravasate blood vessels and build new metastatic formations. This process is primarily influenced by the activity of proteinases called metalloproteinase-MMPs. MMPs play an essential role in the degradation of the stromal connective tissue and basement membrane components which are key elements in tumor invasion and metastasis. MMPs (Matrix Metalloproteinases) are a family of 28 enzymes, containing a zinc ion at the active site of catalysis, that were initially identified on the basis of their ability to cleave most elements of the extracellular matrix (ECM) but have subsequently been found to be upregulated in nearly every tumor type. More recently, exposure to these enzymes has been found to impact cellular signaling pathways that stimulate cell growth at early stages of tumor progression. According to their substrate specificity they are divided into six subclasses: collagenases, gelatinases, stromelysins, matrilysins, membrane-type MMPs and others not classified. In epithelial tumors, the majority of proteinases are synthesized by the responding host stromal cells. MMP-1 (collagenase 1) is expressed robustly by many cell types and degrades all three stromal collagens, making it the foremost player in collagen degradation in many diseases including cancer. Proteases have been shown to be involved in tumor progression as early as conversion to a premalignant phenotype, such as MMP-3 (stromelysin 1). Increased expression of MMPs is predictive of tumor aggressiveness, metastasis and poor patient survival in lung, prostate, stomach, colon, breast, ovary, pancreatic and oral squamous cell cancers. The aim of this thesis was the expression of MMP-1 in protein level and MMP-3 in mRNA and protein level in 77 primary invasive breast carcinomas. To assess the role of these MMPs in breast cancer, their expression was evaluated in relation to a) well established clinicopathologic parameters (menopausal status, tumor size, histologic type, histologic and nuclear grade, lymph node infiltration and stage, b) novel prognostic markers (ER, PR and c-erbB- 2/HER-2 immunohistochemical expression) and c) overall and disease-free patients’ survival. The material was comprised of 77 invasive breast carcinomas (57 ductal and 20 lobular). The mean age of patients was 58 years (range 27 to 86 years). Mean survival time was 82 months while the mean observation period for the disease-free survival was 78 months. Immunohistochemistry (Strept ABC-HRP method) and in situ hybridization (chromogenic-alkaline phosphatase based detection) were performed to detect MMP-1 and MMP-3 proteins and mRNA MMP-3, respectively. Statistical analysis was performed using univariate (x2 test and log rank test) and multivariate (multiple linear regression and Cox’s hazard regression model) methods. MMP-1 and MMP-3 immunoreactivity was detected in 59 (77%) and 22 (28.5%) of 77 invasive breast carcinomas respectively. Immunoreactivity for MMP-1 and MMP-3 was observed in the cytoplasm of cancer cells in 50/77 (65%) and 22/77 (28.5%) cases respectively or in tumor stromal cells in 41/77 (53%) and 2/77 (2.5%) cases, respectively. mRNA MMP-3 was detected in 72 of 77 (93.5%) of invasive breast carcinomas. Transcripts for MMP-3 were located in stromal fibroblasts within the tumor in 68 cases and in stromal fibroblasts at the marginal portion of the tumor in 69 cases. ................

Στα περισσότερα καρκινώματα η θνησιμότητα είναι το αποτέλεσμα της τοπικής διήθη- σης και της μετάστασης των νεοπλασματικών κυττάρων από τον πρωτοπαθή όγκο σε άλλους ιστούς και όργανα. Η διηθητική και μεταστατική ικανότητα των καρκινικών κυττάρων εξαρτά- ται από τις αλλαγές που συμβαίνουν στην εξωκυττάρια θεμέλια ουσία (ΕΘΟ) που περιβάλλει τον πρωτοπαθή όγκο και από τις προσκολλητικές ικανότητες των ίδιων των κυττάρων του όγκο- υ. Η ικανότητα αυτή των καρκινικών κυττάρων εξαρτάται επίσης από τη συνεργασία πολλαπ- λών πρωτεολυτικών ενζύμων τα οποία εκκρίνονται από τα κύτταρα του όγκου ή του μικροπερι- βάλλοντος και των οποίων το υπόστρωμα είναι τα συστατικά της ΕΘΟ. Η αυξημένη πρωτεόλυση είναι ένας δυνητικός μηχανισμός για τα καρκινικά κύτταρα να διασπούν τη βασική μεμβράνη (ΒΜ) επιθηλίων και αγγείων και να εισέρχονται στο διάμεσο στρώμα, όπου αυξάνονται και μεθίστανται σε απομακρυσμένες θέσεις. Μεταξύ των πρωτεολυ- τικών ενζύμων που εμπλέκονται στην ανάπτυξη του όγκου είναι οι Μεταλλοπρωτεϊνάσες (ΜΜPs). Oι MMPs είναι μια οικογένεια 28 ενδοπεπτιδασών, που εξαρτώνται από ιόντα ψευδαρ- γύρου και ασβεστίου και είναι ικανές να αποδομούν τα κολλαγονώδη και μη κολλαγονώδη συσ- τατικά της ΕΘΟ. Με βάση τα υποστρώματα χωρίζονται σε 6 υποομάδες: 1) Κολλαγενάσες (ΜΜΡ-1,-8,-13), 2) Ζελατινάσες (ΜΜΡ-2,-9), 3) Στρωμελυσίνες (ΜΜΡ-3,-10,-11), 4) Ματριλυ- σίνες (ΜΜΡ-7,-26), 5) Μεμβρανικού τύπου (ΜΜΡ-14,-15,-16,-17,-24,-25) και 6) λοιπές με άγ- νωστα υποστρώματα. Υψηλά επίπεδα ΜΜPs έχουν συσχετισθεί με αυξημένη ικανότητα καρκι- νικής διήθησης in vitro και in vivo. Ο πρόσφατος χαρακτηρισμός νεότερων υποστρωμάτων, ό- πως υποδοχείς αυξητικών παραγόντων, μόρια προσκόλλησης, κυτοκίνες, αποπτωτικοί συνδέτες και αγγειογενετικοί παράγοντες καθώς επίσης και ο σχεδιασμός γενετικά τροποποιημένων πει- ραματικών μοντέλων απώλειας ή ενίσχυσης της δράσης τους, έχουν υποδείξει τη συμμετοχή αυ- τών των ενζύμων και στα αρχικά στάδια της καρκινικής ανάπτυξης. Επιπλέον, η υπερέκφρασή τους συχνά συσχετίζεται σε κλινικό επίπεδο με δυσμενή πρόγνωση ασθενών με διάφορα καρκι- νώματα. Σκοπός της διδακτορικής διατριβής ήταν η μελέτη της ΜΜΡ-1, σε πρωτεϊνικό επίπεδο και της ΜΜΡ-3 σε μεταγραφικό και πρωτεϊνικό επίπεδο, σε 77 πρωτοπαθή διηθητικά καρκινώ- ματα. Η έκφραση των ανωτέρω δεικτών υποβλήθηκε σε στατιστική ανάλυση για τη διερεύνηση της σχέσης τους με α) τις γνωστές κλινικοπαθολογοανατομικές παραμέτρους του καρκίνου του μαστού (εμμηνοπαυσιακή κατάσταση, μέγεθος του όγκου, ιστολογικός τύπος, ιστολογικός και πυρηνικός βαθμός κακοήθειας, διήθηση επιχώριων λεμφαδένων, στάδιο νόσου), β) νεότερους προγνωστικούς δείκτες όπως ανοσοϊστοχημική έκφραση ορμονικών υποδοχέων ER, PR και ογ- κοπρωτεϊνης c-erbB-2/HER-2 και γ) την ολική και ελευθέρα νόσου επιβίωση των ασθενών. Με βάση τις συσχετίσεις που προέκυψαν γίνεται εκτίμηση της πιθανής συμμετοχής των ενζύμων αυτών στην επιθετικότητα, διηθητικό δυναμικό και πρόγνωση του καρκίνου του μαστού. Το υλικό αποτέλεσαν 77 πρωτοπαθή διηθητικά καρκινώματα μαστού, 57 πορογενή και 20 λοβιακά, προερχόμενα από 77 θήλεις ασθενείς ηλικίας από 27 έως 86 ετών. Το μέσο διάστη- μα παρακολούθησης για την ολική επιβίωση των ασθενών ήταν 82 μήνες. Εικοσιπέντε ασθενείς εξεδήλωσαν υποτροπές με μέσο διάστημα παρακολούθησης 78 μήνες. Για την εντόπιση των με- τάγραφων της ΜΜΡ-3 εφαρμόσθηκε μη ραδιοϊσοτοπικός, χρωμογόνος in situ mRNA υβριδισ- μός σε τομές παραφίνης, ενώ για τον προσδιορισμό των πρωτεϊνών ΜΜΡ-1 και ΜΜΡ-3 εφαρ- μόσθηκε η ανοσοϊστοχημική μέθοδος τριών βημάτων του συμπλέγματος στρεπταβιδίνης- βιοτίνης-υπεροξειδάσης. Η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων και των επιμέρους συσχετίσεων έγινε με μονοπαραγοντική (x2-test και log rank test) και πολυπαραγοντική (multiple linear regression model και Cox’s hazard regression model) ανάλυση. ................