Μηχανισμοί ενεργοποίησης του μεταγραφικού παράγοντα NF – κΒ από ιούς: ο ρόλος της πρωτεΐνης TRAF6

Abstract

The transcription factors NF - κΒ play an important role in the immunity response. NF - κΒ is activated by a plethora of signaling molecules, such as various cytokines and other substances, bacteria and bacterial parts, as well as viruses, such as the hepatitis C virus (HCV) and the Epstein - Barr virus (EBV). The protein TRAF6 is an E3 ubiquitin ligase that has an important role in the activation of the transcriptional factor NF - κΒ by various stimuli which include the HCV core protein and the EBV oncoprotein LMP1. TRAF6 consists of a highly conserved carboxyl terminal TRAF - C domain, preceded by a coiled coil domain, and of an amino terminal region, which contains a RING domain and a series of zinc fingers. The TRAF - C domain contributes to the oligomerization of the protein and interacts with upstream signaling molecules, while the RING domain is the main element that grants the function of E3 ubiquitin ligase to TRAF6. To determine structural features that are important for TRAF6 - dependent NF - κΒ activation, a series of mutational changes in residues of the TRAF - C and RING domains was undertaken. Mutations of conserved residues residing in the TRAF - C domain did not cause significant changes in the ability of TRAF6 to activate NF - κΒ. On the other hand, mutations of residues located in the RING domain of TRAF6 revealed a number of residues that have a functionally important role which was conserved since homologous amino acids in the corresponding RING domain of TRAF2 were shown to have an important role in TRAF2-induced NF-κB activation. Most of the functionally important residues of the RING domains of TRAF6 and TRAF2 lie on the dimerization interface of these domains, underscoring their functional significance. However, the dimerization capability of the TRAF6 and TRAF2 RING domains was not sufficient for NF-κB activation, indicating the existence of other properties of the dimerization interfaces of these domains that are necessary for the activation of NF-kB. Evaluation of the RING-domain dependent polyubiquitination of TRAF6 showed that this function may be necessary but insufficient for TRAF6-induced activation of NF-κB. Interestingly, a relative correlation between the dimerization capability of the RING domain of TRAF6 and its polyubiquitination was noted, underlying the functional importance of RING domain dimerization for the polyubiquitination of TRAF6. The present study revealed the existence of novel structural and mechanistic elements of TRAF6-mediated signal transduction which will contribute to the development of methods for controlling the activity of TRAF6 and its associated pathologies

Η οικογένεια των μεταγραφικών παραγόντων NF - κΒ διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη διαδικασία της ανοσοαπόκρισης. Ο NF - κΒ ενεργοποιείται από μία πληθώρα εξωκυτταρικών σημάτων, ανάμεσα στα οποία είναι διάφορες κυτοκίνες και άλλες ουσίες, βακτήρια και συστατικά τους, καθώς επίσης και ιοί, όπως είναι ο ιός της ηπατίτιδας C και ο ιός Epstein - Barr. Η πρωτεΐνη TRAF6 είναι μία Ε3 λιγάση ουβικουιτίνης, που διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην ενεργοποίηση του μεταγραφικού παράγοντα NF - κΒ από διάφορα ερεθίσματα στα οποία συμπεριλαμβάνονται ιικοί παράγοντες όπως η πρωτεΐνη core του ιου της ηπατίτιδας C και η πρωτείνη LMP1 του ιού Epstein-Barr. Η TRAF6 αποτελείται από μία ιδιαίτερα συντηρημένη καρβοξυτελική περιοχή, στην οποία υπάρχει η επικράτεια TRAF - C και μία δομή εσπειραμένης έλικας, καθώς και από μία αμινοτελική περιοχή, που περιέχει μία επικράτεια RING και μία σειρά από δακτύλους ψευδαργύρου. Η επικράτεια TRAF - C συνεισφέρει στον ολιγομερισμό της πρωτεΐνης TRAF6 και αλληλεπιδρά με σηματοδοτικά μόρια που βρίσκονται ανοδικά στο μονοπάτι ενεργοποίησης του NF - κΒ, ενώ η επικράτεια RING είναι το κύριο στοιχείο που προσδίδει στην πρωτεΐνη τη λειτουργία της Ε3 λιγάση ουβικουιτίνης. Για να εξακριβωθούν δομικά στοιχεία που συμμετέχουν ενεργά στην επαγόμενη από TRAF6 ενεργοποίηση του NF - κΒ, πραγματοποιήθηκε μία σειρά μεταλλάξεων τόσο στην επικράτεια TRAF - C όσο και στην επικράτεια RING. Μεταλλάξεις που έγιναν σε συντηρημένα αμινοξέα της επικράτειας TRAF - C δεν προκάλεσαν σημαντικές μεταβολές στην ικανότητα της πρωτεΐνης να ενεργοποιεί το μεταγραφικό παράγοντα NF - κΒ. Αντίθετα, οι μεταλλάξεις που έγιναν στην επικράτεια RING της πρωτεΐνης TRAF6 αποκάλυψαν μία σειρά αμινοξέων που έχουν λειτουργικά σημαντικό ρόλο ο οποίος είναι συντηρημένος καθώς δείχθηκε ότι ομόλογα αμινοξέα της επικράτειας RING της πρωτεΐνης TRAF2 είναι επίσης σημαντικά για την ενεργοποίηση του NF-κΒ. Τα περισσότερα από τα λειτουργικά σημαντικά αμινοξέα των επικρατειών RING της TRAF6 και της TRAF2 βρίσκονται στην επιφάνεια διμερισμού των αντίστοιχων επικρατειών υπογραμμίζοντας τη λειτουργική σημασία της συγκεκριμένης περιοχής. Ωστόσο η ικανότητα διμερισμού των επικρατειών RING δεν αποτελεί από μόνη της ικανή συνθήκη για την ενεργοποίηση του NF-κΒ από τις πρωτεΐνες TRAF6 και TRAF2, αναδεικνύοντας έτσι την ύπαρξη άλλων ιδιοτήτων των επιφανειών διμερισμού των επικρατειών αυτών που είναι σημαντικές για το συγκεκριμένο σηματοδοτικό μονοπάτι. Αναλυση της εξαρτώμενης από την επικράτεια RING ικανότητας πολυουβικουιτίνωσης της TRAF6 έδειξε ότι η δράση αυτή μπορεί να είναι αναγκαία αλλα όχι ικανή συνθήκη για την ενεργοποίηση του NF-κΒ από την TRAF6. Παρατηρήθηκε ωστόσο μία συσχέτιση της ικανότητας διμερισμού της επικρατείας RING και της πολυουβικουιτίνωσης της TRAF6, γεγονός που επισημαίνει την πιθανή αναγκαιότητα διμερισμού της επικράτειας RING για την πολυουβικουιτίνωση της TRAF6. Η παρούσα διατριβή κατέδειξε την ύπαρξη νέων δομικών και μηχανιστικών στοιχείων μεταγωγής σήματος από την πρωτεΐνη TRAF6 που θα συμβάλλουν στην ανάπτυξη μεθόδων ελέγχου της δράσης της πρωτεΐνης αυτής και των παθολογικών καταστάσεων στις οποίες συμμετέχει.