Μοριακός και βιοχημικός χαρακτηρισμός βακτηριακών στελεχών εντερικής προέλευσης-προβιοτικές ιδιότητες και επίδρασή τους σε διάφορες ανοσοβιολογικές παραμέτρους σε ποντίκια

Abstract

Probiotics are living microorganisms which upon ingestion in adequate amounts confer health benefits to the host. However, these benefits cannot be extrapolated to other strains without experimentation. The main objective of this thesis was the investigation of the immunomodulatory properties of Lactobacillus strains belonging to different species, and their characterization as presumptive probiotics based on these properties. For this purpose, we used 12 Lactobacillus strains previously isolated from the intestinal tract of infants and Feta cheese. Our first experiments involved the genotypic characterization of these strains using molecular techniques. For Lactobacillus genotypic characterization, the PFGE method proved to be the most effective in comparison with the RAPD-PCR analysis. Since there have not been established so far phenotypic markers which could predict the immunomodulatory capacity of lactobacilli, the selection of presumptive probiotic Lactobacillus strains requires laborious and time-consuming tests in experimental animals as well as the identification of a large number of immunological parameters in the gastrointestinal tract. Given the importance of establishing methods to simplify this procedure, we investigated the use of the air pouch as appropriate in vivo model for the rapid discrimination and selection of probiotic strains belonging to different Lactobacillus species. Lactobacillus administration in the air pouch of mice resulted in discrimination of 3 strains (DC421, DC429 and 2035) which exhibited adjuvant and immunomodulatory activity such as PMN cell recruitment, cytokine production and increased phagocytic capacity of PMN cells. In accordance with the air pouch, oral administration of these strains resulted in the induction of immune responses such as IgA antibody production without the occurrence of inflammation, cytokine production and induction of the expression of different TLRs, in the intestinal mucosa. The results of this thesis demonstrate that the air pouch model provides a suitable environment for the determination of immune responses induced by Lactobacillus strains that are similar to the corresponding immune responses in the small intestine. For this reason, the air pouch system could be used as an alternative and rapid method for the preliminary discrimination and selection of probiotic Lactobacillus strains. In this thesis, we also investigated the mechanism by which the bacterial strains DC421, DC429 and 2035 exhibited their immunomodulatory activity. The results indicate that these strains trigger a balanced Th1/Th2 immune response via a standard cytokine secretion (IFNγ, IL-5, IL-6 and IL-10). This cytokine profile seems to be produced by the mediation of TLR2 and TLR4. Additionally, all strains appear to exhibit specific anti-inflammatory activity concerning the TNF production. The data presented in this thesis contribute to the process of selecting probiotic microorganisms and understanding the mode of their action in the gastrointestinal tract. Furthermore, evidence is provided that the cell surface traits examined may not be the only criteria but an alternative and important component of a complex mechanism that enables a microorganism to interact with the host gut to exert its immunoregulatory activity.

Ως προβιοτικοί χαρακτηρίζονται οι ζωντανοί μικροοργανισμοί που ασκούν ευεργετική δράση στον ξενιστή, όταν καταναλωθούν σε κατάλληλες ποσότητες. Αντικείμενο της διατριβής αυτής αποτέλεσε η διερεύνηση των ανοσοτροποποιητικών ιδιοτήτων των στελεχών του γένους Lactobacillus που ανήκουν σε διαφορετικά είδη και ο χαρακτηρισμός τους ως πιθανά προβιοτικά με βάση τις ιδιότητες αυτές. Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιήθηκαν 12 στελέχη Lactobacillus που απομονώθηκαν από τον εντερικό σωλήνα νεογνών και από τυρί Φέτα. Τα πρώτα πειράματά μας αφορούσαν το γενοτυπικό χαρακτηρισμό των στελεχών αυτών με μοριακές τεχνικές. Η PFGE αποδείχτηκε ως η πλέον αποτελεσματική μέθοδος, σε σύγκριση με την RAPD-PCR, για το γενοτυπικό χαρακτηρισμό των Lactobacillus. Δεδομένου ότι δεν έχουν καθιερωθεί έως τώρα φαινοτυπικοί δείκτες που θα μπορούσαν να προβλέψουν την ανοσοτροποποιητική ικανότητα των Lactobacillus, η επιλογή των πιθανών προβιοτικών στελεχών του γένους απαιτεί επίπονες και χρονοβόρες δοκιμές σε πειραματόζωα καθώς και τον προσδιορισμό ενός μεγάλου αριθμού ανοσοβιολογικών παραμέτρων στο γαστρεντερικό σωλήνα. Λαμβάνοντας υπόψη τη σημασία της καθιέρωσης μεθόδων που απλοποιούν την παραπάνω διαδικασία, διερευνήθηκε η χρήση του αεροθύλακα ως κατάλληλου in vivo μοντέλου για την ταχεία διάκριση και επιλογή, με βάση την ανοσοτροποποιητική τους ικανότητα, των προβιοτικών στελεχών που ανήκουν σε διαφορετικά είδη του γένους Lactobacillus. Η χορήγηση των Lactobacillus στον αεροθύλακα των ποντικών είχε ως αποτέλεσμα τη διάκριση 3 στελεχών (DC421, DC429 και 2035) που επέδειξαν ανοσοενισχυτική-ανοσοτροποποιητική δράση, όπως η συσσώρευση μεγάλου αριθμού ΠΜΠ κυττάρων, η παραγωγή κυτοκινών και η αύξηση της φαγοκυτταρικής ικανότητας των ΠΜΠ κυττάρων. Παρόμοια με τον αεροθύλακα, η στοματική χορήγηση των στελεχών αυτών προκάλεσε στον εντερικό βλεννογόνο την επαγωγή ανοσοβιολογικών αποκρίσεων, όπως η παραγωγή IgA αντισωμάτων χωρίς την εκδήλωση φλεγμονώδους αντίδρασης, η παραγωγή κυτοκινών καθώς και η επαγωγή της έκφρασης διαφόρων TLRs. Τα αποτελέσματα της διατριβής δείχνουν ότι το μοντέλο του ραχιαίου αεροθύλακα παρέχει το κατάλληλο περιβάλλον για τον προσδιορισμό των ανοσοαποκρίσεων που επάγονται από τα στελέχη των Lactobacillus, και οι οποίες προσομοιάζουν τις αντίστοιχες ανοσοαποκρίσεις στο λεπτό έντερο. Για το λόγο αυτό, το σύστημα του αεροθύλακα μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως μία εναλλακτική και γρήγορη μέθοδος για την προκαταρκτική διάκριση και επιλογή των προβιοτικών στελεχών του γένους Lactobacillus. Στη διατριβή αυτή, διερευνήθηκε επίσης ο μηχανισμός με τον οποίο τα βακτηριακά στελέχη DC421, DC429 και 2035 ασκούν την ανοσοτροποποιητική τους δράση. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι τα στελέχη αυτά ενεργοποιούν ισοζυγισμένη Th1/Th2 ανοσοαπόκριση που επιτυγχάνεται με την έκκριση συγκεκριμένου προτύπου κυτοκινών (IFNγ, IL-5, IL-6 και IL-10). Το πρότυπο αυτό φαίνεται να παράγεται με τη μεσολάβηση των TLR2 και TLR4. Επιπρόσθετα, όλα τα στελέχη φαίνεται να διαθέτουν εξειδικευμένη αντι-φλεγμονώδη δράση, όσον αφορά την παραγωγή του TNFα. Οι πληροφορίες που παρουσιάζονται στη διατριβή συμβάλλουν στη διαδικασία της επιλογής και της κατανόησης του τρόπου δράσης των προβιοτικών μικροοργανισμών στο γαστρεντερικό σωλήνα. Τα δεδομένα δείχνουν ότι τα χαρακτηριστικά της κυτταρικής μεμβράνης των Lactobacillus δεν αποτελούν το μοναδικό και αναγκαίο κριτήριο για τον καθορισμό της ανοσοτροποποιητικής τους δράσης, αλλά ένα εναλλακτικό και σημαντικό συστατικό ενός πιο περίπλοκου μηχανισμού που επιτρέπει στους μικροοργανισμούς να αλληλεπιδρούν με τα κύτταρα του εντέρου του ξενιστή και να ασκούν την ανοσοτροποποιητική τους δράση.