Μελέτη της έκφρασης του CFTR γονιδίου σε μεταλλάξεις ματίσματος (splicing mutations)

Abstract

The effects of eight splicing mutations, one nonsense and 2 missense mutations on Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) gene expression, were investigated by RT-PCR analysis of mRNA extracted from nasal epithelial cells harvested from patients harbouring the mutations. We studied 4 subjects with c.621+3A>G, one with c.2751+2T>A, one with c.296+1G>C, one with c.1898+1G>T, seven with 3120+1G>A, 3 with 1525-1G>A, eighteen with 2789+5G>A, 7 with c.711+3A>G, five with p.E822X, 7 with p.D565G and one with p.G576A and compared the results to CFTR mRNA from normal subjects. Our results show that mutations c.621+3A>G, c.2751+2T>A, c.296+1G>C, c.1898+1G>A, c.3120+1G>A that disrupt the 5’ splice donor sites of introns 4, 14a, 2, 12 and 16 respectively, and c.1525-1G>A, which disrupts the 3’ splice acceptor site of intron 9 and nonsense p.E822X all result in severe deficiency of normal CFTR mRNA. The patients with severe mutations have severe clinical phenotype with both the pancreatic and pulmonary function affected. While mutations c.2789+5G>A and c.711+3A>G result in moderate deficiency of normal CFTR mRNA and therefore milder phenotype in the patients. Finally the two missense mutations p.D565G and p.G576A also result in the production of aberrantly spliced mRNA in nasal epithelial cells lacking exon 12, by affecting the exonic splicing enhancer sequences of the exon. The effect of single nucleotide substitutions on ESE/ESS cannot be accurately predicted by either SR matrices or enhancer identification. The recognition and characterization of splicing abnormalities, caused by exon sequence variations on regulatory elements, may represent a frequent disease-causing mechanism that also relates to the phenotypic variability. This information is especially useful for phenotype prediction of patients harbouring the above mutations and for genetic counselling. By characterizing the major aberrantly splicing products of the above mutations we could design oligomeric junction probes for hybridization of sequences: exon–exon (normal); exon n-exon n+2 (skipping of 1 exon); and additional oligomeric probes covering cases where the aberrant transcript includes part of an exon or intron sequences. The CF-splicing CHIP will be developed on the NanoChip® 400 Molecular Biology Workstation which should offer accurate and rapid detection of any splicing abnormality on cDNA products of CF patients.

Ο σκοπός της εργασίας ήταν η μελέτη της έκφρασης στο επίπεδο της μεταγραφής 8 μεταλλάξεων ματίσματος, που εδράζονται στις 5’ και 3’ περιοχές συρραφής εξονίων (θέσεις δότη και αποδέκτη), 2 παρερμηνεύσιμων μεταλλάξεων που βρίσκονται σε ρυθμιστικές περιοχές του εξονίου 12 και μίας μετάλλαξης τερματισμού του εξονίου 13 του CFTR mRNA. Όλες οι παραπάνω μεταλλάξεις επηρεάζουν τη σωστή παραγωγή ή και σταθερότητα του CFTR mRNA. Χρησιμοποιήθηκαν επιθηλιακά κύτταρα ρινικού βλεννογόνου 55 ασθενών ΚΙ και ετεροζυγωτών με τις υπό μελέτη μεταλλάξεις διότι αποτελεί ιστό εύκολα προσβάσιμο και όπου εκφράζεται το CFTR γονίδιο. Τα αποτελέσματα των μεταλλάξεων συγκρίθηκαν με ισάριθμα δείγματα φυσιολογικών μαρτύρων. Οι μεταλλάξεις c.621+3A>G, c.2751+2T>A, c.1898+1G>T, c.296+1G>C, 3120+1G>A που διαταράσσουν τις διατηρημένες αλληλουχίες ματίσματος στο 5’ των ιντρονίων, και η μετάλλαξη c.1525-1G>A η οποία διαταράσσει τη συντηρημένη αλληλουχία ματίσματος στο 3’ του ιντρονίου 9 καθώς και η ανερμηνεύσιμη μετάλλαξη p.Ε822Χ έχουν ως αποτέλεσμα δραστικά μειωμένη παραγωγή φυσιολογικών CFTR μεταγράφων (6-40%). Η μειωμένη ποσότητα ή μειωμένη σταθερότητα των CFTR μεταγράφων που παράγονται από τις παραπάνω μεταλλάξεις έχει ως αποτέλεσμα βαρύ κλινικό φαινότυπο στους ασθενείς. Αντίθετα οι μεταλλάξεις c.711+3A>G (5’ του ιντρονίου 5), και 2789+5G>A (5’ του ιντρονίου 14b) είναι ήπιες με αυξημένα ποσοστά φυσιολογικών μεταγράφων και ηπιότερο κλινικό φαινότυπο. Τέλος οι 2 παρερμηνεύσιμες μεταλλάξεις p.D565G και p.G576A, δρουν ως μεταλλάξεις ματίσματος προκαλώντας έλλειμμα του εξονίου 12, όπου εδράζονται. Επομένως παρερμηνεύσιμες μεταλλάξεις ή ακόμη και μεταλλάξεις συνώνυμες (χωρίς αλλαγή αμινοξέος) μπορεί να επηρεάσουν ρυθμιστικές αλληλουχίες ματίσματος (ESE και ESS) μέσα στα εξόνια καταλήγοντας σε παθολογικό μάτισμα και παραγωγή ποσοστού παθολογικών μεταγράφων μεγαλύτερου του 30-40%. Η δράση αυτή των παρερμηνεύσιμων ή συνώνυμων αλλαγών μπορεί να ερευνηθεί μόνο μελετώντας πρότυπο ματίσματος στο mRNA του CFTR γονιδίου σε ιστούς (όπως επιθηλιακά κύτταρα) όπου το γονίδιο εκφράζεται. Τα συμπεράσματα της μελέτης όσον αφορά τα προϊόντα που συνήθως παράγονται από τις μεταλλάξεις ματίσματος μας έδωσαν την δυνατότητα να σχεδιάσουμε ολιγονουκλεοτίδια ανιχνευτές για τον εύκολο και ταχύ χαρακτηρισμό αυτών των μεταλλάξεων στο CFTR γονίδιο χρησιμοποιώντας την πλατφόρμα του NanoChip® 400 Molecular Biology Workstation.