Μελέτη των παθογενετικών μηχανισμών του συνδρόμου οξείας αναπνευστικής δυσχέρειας (ARDS)

Abstract

Background-Aims: Inhibition of neutrophil apoptosis and apoptotic death of epithelial (pneymocytes and endothelial) cells are potential pathogenic mechanisms of ALI/ARDS. The aim of this study was to evaluate the potential pathogenic role of apoptosis and its inhibition by a pan-caspase inhibitor (Z.vad.fmk or zvad) in the lung in a murine model of LPS-induced ALI/ARDS. Materials and Methods: In 43 C57B1/6 male mice ALI/ARDS was induced by LPS injection i.p. using LD45 dosage while 5 mice were the controls. Survival was observed in 15 LPS animals and in 15 LPS mice that were treated with zvad ALI/ARDS course over time was evaluated 8 hours after LPS (in 7 mice, LPS-8 group), 24 hours after LPS (6 animals, LPS-24 group) and the 8 surviving LPS animals from the survival group (LPS-72). Histological evaluation, wet lung weight per body weight and wet/dry weight ratio were used to confirm ALI/ARDS. TNF-α and MDA levels in lung tissue were measured. Using flow cytometry neutrophil, mononuclear-macrophage and epithelial counts were determined as well as their apoptotic profile and caspase-3 expression. Results: Pathologic ALI/ARDS score was the only significant prognostic factor in our study and it was significantly higher in all LPS receiving animals compared to the controls. Zvad administration significantly lowered it without adding a survival benefit. TNF-α levels were significantly lower than the controls 72 hours after LPS administration. In non-surviving LPS animals TNF-α levels were higher than the controls and zvad administration lowered them to the controls’ level. MDA did not vary significantly between study groups. Healthy and apoptotic neutrophil counts were increased by zvad in non-surviving animals due to LPS induced ALI/ARDS. Eight hours after LPS administration caspase-3 positive healthy neutrophils were doubled compared to the controls Zvad administration overall lowered them to the controls’ level. Epithelial (pneymocytes and endothelial) cells did not vary significantly over time while zvad administration increased their counts especially among mice surviving ALI/ARDS. Conclusions: Neutrophil and epithelial cell apoptosis was not the primary pathogenic mechanism in a murine LPS induced ALI/ARDS model employing LD45 as evaluated by flow cytometry. Since apoptosis inhibition significantly improved pathologic ALI/ARDS score which was the only significant prognostic factor in our study, further study is advocated.

Εισαγωγή-Σκοποί: Η φλεγμονώδης διήθηση από ουδετερόφιλα πολυμορφοπύρηνα και η καταστροφή των πνευμονοκυττάρων τύπου Ι και II αλλά και των ενδοθηλιακών κυττάρων στον πνεύμονα αποτελούν βασικά στοιχεία στην πορεία του ALI/ARDS. Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η διερεύνηση του ενδεχόμενου παθογενετικού ρόλου της απόπτωσης στον πνευμονικό ιστό συνολικά αλλά και στους διάφορους κυτταρικούς υποπληθυσμούς σε ένα πειραματικό μοντέλο ALI/ARDS σε μύες. Επίσης μελετήθηκαν τα αποτελέσματα της χορήγησης ενός ευρέος φάσματος αναστολέα των κασπασών (Ζ.vad.fmk). Υλικό και Μέθοδος: Χρησιμοποιήθηκαν 48 αρσενικοί μύες C57B1/6 στους 43 από τους οποίους προκλήθηκε ALI/ARDS με τη ενδοπεριτοναϊκή χορήγηση LPS σε δόση ίση με την LD45 ενώ οι υπόλοιποι 5 μύες αποτέλεσαν την ομάδα ελέγχου. Η μελέτη του ALI/ARDS έγινε στις 8 (n=7), 24 (n=6) και 72 ώρες (n=8) μετά τη χορήγηση του LPS ενώ για τη μελέτη επιβίωσης χρησιμοποιήθηκαν 30 μύες με ALI/ARDS στους 15 από τους οποίους χορηγήθηκε Ζ.vad.fmk. Η ύπαρξη και η βαρύτητα του ALI/ARDS εκτιμήθηκε παθολογοανατομικά και μετρήθηκε το περιεχόμενο υγρό πνεύμονα /ΣΒ, αλλά και ο λόγος υγρού/ξηρό βάρος. Προσδιορίστηκαν αρχικά ο TNF-α και τα επίπεδα MDA στον πνευμονικό ιστό. Ακολούθως, με τη χρήση κυτταρομετριας ροής έγινε ποσοτικός προσδιορισμός των επιθηλιακών, ουδετερόφιλων πολυμορφοπύρηνων και μακροφάγων και διακρίθηκαν οι υγιείς αποπτωτικοί και νεκρωτικοί πληθυσμοί όπως επίσης και οι θετικοί στην έκφραση της κασπάσης-3 με χρήση κατάλληλων αντισωμάτων. Έγινε μελέτη της επιβίωσης και αναζητήθηκαν προγνωστικοί παράγοντες του συνδρόμου ALI/ARDS μεταξύ των προαναφερθέντων μεταβλητών. Αποτελέσματα: Η ιστολογική βαρύτητα του ALI/ARDS ήταν υψηλότερη σε όλα τα πειραματόζωα που έλαβαν LPS σε σχέση με τους μάρτυρες και ήταν ο μοναδικός ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας. Η χορήγηση Ζ.vad.fmk βελτίωσε σημαντικά την παθολογοανατομική βαρύτητα του συνδρόμου χωρίς ωστόσο να βελτιώνει την επιβίωση. Στις 72 ώρες μετά τη χορήγηση LPS οι τιμές του TNF-α έφτασαν στη χαμηλότερη τιμή τους. Στα πειραματόζωα που απεβίωσαν τα επίπεδα TNF-α ήταν αυξημένα ενώ η χορήγηση του zvad τα μείωσε στα επίπεδα των μαρτύρων. Δεν ανευρέθηκε στατιστικά σημαντική διακύμανση των επίπεδων MDA στις διάφορες στιγμές του ALI/ARDS. Η χορήγηση του zvad οδήγησε σε αύξηση των υγιών και αποπτωτικών ουδετερόφιλων στα πειραματόζωα που απεβίωσαν λόγω ALI/ARDS. Τα θετικά στην κασπάση-3 υγιή ουδετερόφιλα 8 ώρες μετά το LPS ήταν διπλάσια σε σχέση με τους μάρτυρες και το zvad τα μείωσε στο επίπεδο των μαρτύρων. Αντίθετα τα επιθηλιακά κύτταρα (πνευμονοκύτταρα και ενδοθηλιακά) δεν εμφάνισαν στατιστικά σημαντικές διακυμάνσεις στις διάφορες χρονικές στιγμές ενώ το zvad αύξησε σημαντικά το ποσοστό τους συνολικά και κυρίως στα πειραματόζωα που επιβίωσαν του ALI/ARDS. Συμπεράσματα: Η απόπτωση δεν είναι ο πρωταρχικός παθογενετικός μηχανισμός σε πειραματικό μοντέλο επιβίωσης του συνδρόμου ALI/ARDS που προσομοιάζει την επιβίωση του κλινικού συνδρόμου ανεξαρτήτως του μελετώμενου κυτταρικού υποπληθυσμού. Εφόσον η αναστολή της απόπτωσης επηρεάζει την ιστολογική βαρύτητα που είναι και ο μοναδικός ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας του ALI/ARDS απαιτείται περαιτέρω μελέτη.