Μελέτη της αλληλεπίδρασης ελεύθερων και συνδεδεμένων στην κυτταρική μεμβράνη μορίων HLA-A2.1 με ακινητοποιημένο αντίσωμα μέσω ακουστικού βιοαισθητήρα

Abstract

Biosensors provide an attractive alternative to classic methods of analysis, as they offer the possibility of label-free, real time detection. Love wave acoustic biosensors are able to detect changes in mass and viscoelastic properties at the solid-liquid interface with high sensitivity and have been used, in recent years, in several biological applications. In this work, we present the first application of these devices in the detection of whole cells and in the kinetic study of cellular interactions. Their application in the study of the interaction between the HLA-A2.1 molecules and the immobilized antibody is also presented. Initially we developed a sensing surface suitable for the study of free and cell membrane bound HLA-A2.1 molecules. The device was optimized through comparison of several combinations of materials for the waveguide, in order to achieve better stability and lower signal drift. The combination selected was Novolac/Au (non-grounded). The second step was the immobilization of appropriate biomolecules on the surface. Initially, a peptide presented by the HLA-A2.1 molecules was selected (ΗER2/neu 9369) and two methods were used for its immobilization. However, it was not possible to construct a reproducible surface. To overcome this problem, a monoclonal anti-HLA-A2.1 antibody was used as the biological recognition element, in order to achieve a well defined system. The immobilization was achieved through adsorption on protein A (or G for later experiments) and the method was optimized regarding the buffer and the protein A concentration. The surface was used to detect the binding of cells that express the HLA-A2.1 molecules. Initial experiments allowed the selection of suitable experimental conditions regarding the flow rate, the time length of interaction of the cells with the surface and the quantity used to monitor the interaction which, in this case, must be the amplitude of the wave (instead of the phase, which is the quantity used in the case of proteins). These were followed by the study of the binding of three cell lines in various concentrations. These lines (LG2, JY and T2) are homozygous with respect to the HLA-A2.1 molecules, but differ in some properties such as cell size and number of HLA-A2.1 molecules per cell. It was concluded that the biosensor used is able to successfully detect the binding of cells on the sensor surface and also the differences in properties between different cell lines. The detection is based on the change of the wave amplitude and this fact indicates that the main change is observed in the viscoelastic properties of the surface. The observation that the cell layer behaves as a viscoelastic material led to the calculation of an apparent viscosity for the cell layer. This calculation was based on the use of several concentrations of glycerol of known viscosity and the comparison of the signal change caused by them with the signal change observed during cell binding. The apparent viscosity measured was 1.2-1.8 mPa?s. The microscopic observation of the surface at the end of each experiment confirmed the results and prοvided further information regarding the amplitude change per cell as well as the deformation of cells on the surface. The experimental observations allowed the formation of a model describing the interaction of cells with the immobilized antibody. The kinetic study of this interaction was based on this model, while two approaches were used. In the first, the rate of amplitude change was considered to be proportional to the fractional coverage of the surface by cells. The reaction rate constant k was then calculated and found to be 10?10 (cell/mL)?1?s?1. In the second, it was assumed that the reaction rate is proportional to the creation of further connections and a theoretical mathematical description of the interaction was reached. ...........................................................................................

Οι βιοαισθητήρες παρέχουν μία ελκυστική εναλλακτική λύση στις κλασσικές μεθόδους ανάλυσης καθώς δίνουν τη δυνατότητα συνεχούς παρακολούθησης βιολογικών αλληλεπιδράσεων και μάλιστα χωρίς σήμανση των μορίων που συμμετέχουν. Οι ακουστικοί αισθητήρες Love ανιχνεύουν μεταβολές μάζας και ιξωδοελαστικών ιδιοτήτων στη μεσεπιφάνεια στερεού-υγρού με υψηλή ευαισθησία και έχουν χρησιμοποιηθεί τα τελευταία χρόνια σε αρκετές βιολογικές εφαρμογές. Στην παρούσα εργασία παρουσιάζεται η πρώτη εφαρμογή τους στην ανίχνευση κυττάρων καθώς και στη μελέτη της κινητικής κυτταρικών αλληλεπιδράσεων. Επίσης παρουσιάζεται η εφαρμογή τους στη μελέτη της κινητικής της αλληλεπίδρασης μορίων HLA-A2.1 με ακινητοποιημένο αντίσωμα. Αρχικά αναπτύχθηκε επιφάνεια κατάλληλη για τη μελέτη ελεύθερων αλλά και συνδεδεμένων στην κυτταρική μεμβράνη μορίων HLA-A2.1. Αυτό έγινε με βελτιστοποίηση της διάταξης του βιοαισθητήρα, μέσω επιλογής κατάλληλου συνδυασμού υλικών για τον κυματοδηγό, ώστε να επιτυγχάνεται καλύτερη σταθερότητα στη μεταβολή αγωγιμότητας και χαμηλότερη ολίσθηση του σήματος. Ο συνδυασμός που επελέγη ήταν Novolac/Au χωρίς γείωση. Ακολούθησε η ακινητοποίηση κατάλληλων βιομορίων στην επιφάνεια. Αρχικά επελέγη πεπτίδιο που παρουσιάζεται από τα μόρια HLA-A2.1 (ΗER2/neu 9369) και χρησιμοποιήθηκαν δύο μέθοδοι για την ακινητοποίησή του, αλλά δεν κατέστη δυνατή η δημιουργία επιφάνειας που να αλληλεπιδρά με τα κύτταρα με επαναλήψιμο τρόπο. Έτσι, ακολούθησε ακινητοποίηση μονοκλωνικού αντισώματος ειδικού για τα HLA-A2.1 (BB7.2), ώστε να έχουμε ένα καλύτερα καθορισμένο σύστημα. Η ακινητοποίηση έγινε μέσω προσρόφησης σε πρωτεΐνη Α ή G και η μέθοδος βελτιστοποιήθηκε όσον αφορά το ρυθμιστικό διάλυμα και τη συγκέντρωση πρωτεΐνης Α. H εξειδικευμένη βιολογική μεσεπιφάνεια που αναπτύχθηκε χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση της πρόσδεσης κυττάρων που εκφράζουν τα μόρια HLA-A2.1. Αρχικά πραγματοποιήθηκαν αναγνωριστικά πειράματα που επέτρεψαν την επιλογή κατάλληλων πειραματικών συνθηκών όσον αφορά την ταχύτητα ροής, τη διάρκεια αλληλεπίδρασης των κυττάρων με την επιφάνεια και την παράμετρο που χρησιμοποιείται για την παρακολούθηση της αλληλεπίδρασης, η οποία πρέπει να είναι το πλάτος και όχι η φάση του κύματος (αντίθετα απ’ ό,τι συμβαίνει στην περίπτωση πρόσδεσης πρωτεϊνών). Ακολούθησε η μελέτη της σύνδεσης στην επιφάνεια τριών κυτταρικών σειρών σε διάφορες συγκεντρώσεις. Οι σειρές αυτές (LG2, JY και T2) είναι ομόζυγες ως προς τα μόρια HLA-A2.1, αλλά διαφέρουν σε κάποιες ιδιότητες (μέγεθος κυττάρων και αριθμός HLA-A2.1 στην επιφάνεια του κυττάρου). Από τη μελέτη αυτή προέκυψε το συμπέρασμα ότι ο βιοαισθητήρας που χρησιμοποιήθηκε ανιχνεύει με επιτυχία όχι μόνο τη σύνδεση των κυττάρων αλλά και τις διαφορές που αναφέρθηκαν. Η ανίχνευση βασίζεται στη μεταβολή του πλάτους του κύματος, γεγονός που υποδηλώνει ότι η βασική μεταβολή παρατηρείται στις ιξωδοελαστικές ιδιότητες και όχι στη μάζα της επιφάνειας. Άρα η στιβάδα των κυττάρων συμπεριφέρεται ως ιξωδοελαστικό στρώμα και όχι ως άκαμπτη μάζα. Με βάση την παρατήρηση αυτή υπολογίστηκε ένα φαινόμενο ιξώδες για το στρώμα αυτό. Ο υπολογισμός βασίστηκε στη χρήση διαφόρων συγκεντρώσεων γλυκερόλης γνωστού ιξώδους και σύγκριση της μεταβολής του σήματος που προκαλείται από αυτές με τη μεταβολή που προκύπτει κατά τη σύνδεση των κυττάρων. Το φαινόμενο ιξώδες που μετρήθηκε ήταν 1,2-1,8 mPa?s, ανάλογα με την σειρά. .......................................................