Υπερμοριακά συστήματα σχηματιζόμενα από την αλληλεπίδραση λιποσωμάτων με δενδριτικά πολυμερή

Abstract

In the present study the interaction between dendritic polymers, modified at their surface with guanidinium groups, with liposomes consisting of PC:Chol:DHP andthe DHP bearing the phosphate group at its polar head, was investigated. The interaction process involves molecular recognition of the complementary guanidinium and phosphate groups through combined electrostatic interaction and hydrogen-bonding formation. Dendrimers of two different generations were functionalized with guanidinium groups. The degree of functionalization, the distance between the dendrimeric surface and the guanidinium group and the balance between hydrophilic and hydrophobic surface groups was modified with the objective to investigate the effect of these characteristics on molecular recognition. Taking into account that most membrane transporters exhibit cell-penetrating ability due to the presence of L-arginine and especially to the guanidinium group, the ability of guanidinylated dendritic polymers to translocate across model liposomal membranes was also investigated. The results were further established with in vitro experiments by monitoring the cellular uptake of the guanidinylated dendritic polymers employing A549 cells. For this purpose the dendritic polymers’ surface groups were partially guanidinylated while the remaining surface groups were interacted either with acetic anhydride or propylene oxide. Furthermore, dendrimeric derivatives bearing a small spacer between surface groups and guanidinium groups were prepared, as well as a derivative functionalized with L-arginine. Introduction of the guanidinium group was also performed on two generations of dendritic poly-lysines. The interaction revealed that when low guanidinium/phosphate molar ratios or when dendrimeric derivatives with low degree of functionalization were employed, no size increase of the initially prepared small unilamellar liposomes was found. However, at high guanidinium/phosphate molar ratios or when highly guanidinylated dendrimeric derivatives were employed, aggregation occurred. Between different generation dendrimeric derivatives bearing the same degree of functionalization, the higher generation derivative led to increased aggregation. Furthermore, the organization of the lipid bilayer affected the interaction, since at the liquid crystalline phase aggregation was enhanced. The examination of the nature of the aggregates has shown that they primarily consist of large supramolecular structures, which are formed through fusion of the interacting small unilamellar liposomes towards multi-compartment structures. Fusion takes place under a non-leakage process involving lipid mixing and subsequent mixing of the liposomal aqueous core. However, fusion is enhanced when the bilayer is in the liquid-crystalline phase or at high guanidinium/phosphate molar ratios or when highly functionalized dendrimeric derivatives were employed. Using fluorescence quenching experiments employing FITC-labeled dendrimeric derivatives, their ability to translocate across the liposomal bilayer was investigated at low guanidinium/phosphate molar ratios. Their translocation ability is dependant on the dendrimer generation, the degree of surface functionalization and the organization of the lipid bilayer. Highly guanidinylated derivatives were unable to penetrate the liposomal bilayer. For different generation derivatives bearing the same degree of functionalization, only the low generation proved efficient penetrant. From these results it becomes evident that an appropriate balance between hydrophilic and hydrophobic surface groups is required in order to achieve effective translocation across the liposomal bilayer. Finally, the results obtained by employing liposomes as model membranes were further established by in vitro experiments, where the ability of the dendrimeric derivatives to translocate across the cell membrane was established. The dendrimeric derivatives were localized at the cytosol, the nuclear membrane and the nucleus. The experimental results suggest a translocation mechanism which is based on the neutralization of the charged guanidinium groups by the complementary phosphate groups and the subsequent formation of a non polar complex which, along with the presence of hydrophobic groups on the dendrimeric surface, is able to translocate across the lipid bilayer

Στην παρούσα διδακτορική διατριβή μελετήθηκε η αλληλεπίδραση δενδριτικών πολυμερών, τροποποιημένων στην επιφάνειά τους με την γουανιδική ομάδα, με λιποσώματα αποτελούμενα από PC:Chol:DHP, με το DHP να έχει ως πολική κεφαλή την φωσφορική ομάδα. Η αλληλεπίδραση των συστημάτων αυτών πραγματοποιείται μέσω της μοριακής αναγνώρισης των συμπληρωματικών αναγνωρίσιμων γουανιδικών-φωσφορικών ομάδων μέσω ηλεκτροστατικής αλληλεπίδρασης και σχηματισμού δεσμών υδρογόνου. Δενδριμερή δυο διαφορετικών γενεών τροποποιήθηκαν με γουανιδικές ομάδες, διαφοροποιώντας τον ποσοστό τροποποίησής τους, την απόστασή τους από την επιφάνεια των δενδριμερών και την ισορροπία μεταξύ υδρόφιλων και υδρόφοβων επιφανειακών ομάδων, με στόχο την μελέτη της επίδρασης των παραπάνω χαρακτηριστικών στην διαδικασία της μοριακής αναγνώρισης. Επιπλέον, με δεδομένο το γεγονός ότι πολλοί μεμβρανικοί μεταφορείς οφείλουν την ιδιότητά τους αυτή στην παρουσία της L-αργινίνης και γουανιδικής ομάδας, μελετήθηκε η ικανότητα των γουανιδιωμένων δενδριμερικών να διαπερνούν την λιποσωμική μεμβράνη, θεωρώντας αυτήν ως ένα ικανοποιητικό μοντέλο της κυτταρικής μεμβράνης. Τέλος, χρησιμοποιώντας την κυτταρική σειρά Α549 ελέγχθηκε η ορθότητα των αποτελεσμάτων με in vitro πειράματα. Για τον σκοπό αυτό οι επιφανειακές ομάδες των δενδριμερών τροποποιήθηκαν μερικώς με γουανιδικές ομάδες και οι υπόλοιπες αδρανοποιήθηκαν είτε με αντίδραση με οξικό ανυδρίτη είτε με προπυλενοξείδιο. Επιπλέον, συνετέθησαν δενδριμερή όπου μεταξύ των επιφανειακών ομάδων και της γουανιδικής ομάδας παρεμβάλεται μικρή επεκτατική αλυσίδα, καθώς και ένα δενδριμερές τροποποιημένο με L-αργινίνη. Τέλος, εισαγωγή γουανιδικών ομάδων έγινε και σε δυο γενιές δενδριτικών πολυ-λυσινών. Η μελέτη της αλληλεπίδρασης έδειξε πως σε μικρές μοριακές αναλογίες των συμπληρωματικών αναγνωρίσιμων ομάδων ή όταν χρησιμοποιούνται δενδριμερή με μικρό ποσοστό τροποποίησης, δεν παρατηρείται μεταβολή των διαστάσεων των αρχικών μικρών μονοστοιβαδικών λιποσωμάτων. Αντίθετα, σε μεγάλες μοριακές αναλογίες ή όταν χρησιμοποιούνται δενδριμερή με υψηλό ποσοστό γουανιδίωσης, σχηματίζονται μεγάλα συσσωματώματα. Συγκρίνοντας δενδριμερή του ίδιου ποσοστού τροποποίησης αλλά διαφορετικής γενιάς, το μεγαλύτερο δενδριμερές προκαλούσε εντονότερη συσσωμάτωση. Επιπλέον, η οργάνωση της λιπιδικής διπλοστοιβάδας επηρεάζει την αλληλεπίδραση, καθώς όταν αυτή βρίσκεται στην υγρή κρυσταλλική φάση η συσσωμάτωση γίνεται εντονότερη. Η εξέταση της μορφολογίας των συσσωματωμάτων έδειξε πως αυτά είναι ουσιαστικά μεγαλύτερες υπερμοριακές δομές λιποσωμικής φύσεως που σχηματίζονται λόγω της σύντηξης των αρχικών μικρών λιποσωμάτων προς νέες πολυκυστιδικές δομές. Η διαδικασία αυτή λαμβάνει χώρα χωρίς διάσπαση των μεμβρανών των αρχικών λιποσωμάτων αλλά με συνένωσή τους και ανάμειξη των εσωτερικών υδατικών τους διαμερισμάτων. Η διαδικασία της σύντηξης ενισχύεται από την αύξηση της μοριακής αναλογίας των συμπληρωματικών αναγνωρίσιμων ομάδων, του ποσοστού τροποποίησης των δενδριμερών, της ρευστότητας της λιπιδικής μεμβράνης και της γενιάς του δενδριμερούς. Με μετρήσεις απόσβεσης φθορισμού και χρησιμοποιώντας επισημασμένα δενδριμερή με ισοθειοκυανική φθορεσκεΐνη (FITC) μελετήθηκε η ικανότητά τους να διαπερνούν την λιποσωμική μεμβράνη σε μικρές μοριακές αναλογίες γουανιδικής/φωσφορικής ομάδας. Η ικανότητά τους αυτή είναι εξαρτημένη από την γενιά του δενδριμερούς, το ποσοστό τροποποίησής τους και από την ρευστότητα της μεμβράνης. Τα υψηλώς γουανιδιωμένα δενδριμερή αδυνατούν να διαπεράσουν την λιπιδική μεμβράνη, ενώ για δενδριμερή του ίδιου ποσοστού τροποποίησης αυτό της μικρότερης γενιάς εμφάνισε δραστικότητα. Από τα αποτελέσματα καθίσταται εμφανές πως είναι απαραίτητη μια ισορροπία μεταξύ υδρόφιλων και υδρόφοβων ομάδων που επιτρέπει στο δενδριμερές να διασχίσει την λιποσωμική μεμβράνη. Τέλος, τα αποτελέσματα που προέκυψαν χρησιμοποιώντας τα λιποσώματα ως μοντέλα κυτταρικών μεμβρανών επιβεβαιώθηκαν και από in vitro πειράματα, όπου πιστοποιήθηκε η ικανότητα των δενδριμερικών παραγώγων να διαπερνούν την κυτταρική μεμβράνη και να εντοπίζονται στο κυτταρόπλασμα ή την πυρηνική μεμβράνη ή τον πυρήνα. Όλα τα παραπάνω συνηγορούν στην παρουσία ενός μηχανισμού που βασίζεται αρχικά στην εξουδετέρωση των φορτισμένων γουανιδικών ομάδων από τις φωσφορικές μέσω της μοριακής τους αναγνώρισης, με αποτέλεσμα τον σχηματισμό ενός μη πολικού συμπλόκου, το οποίο σε συνδυασμό με την παρουσία υδρόφοβων ομάδων στην επιφάνεια του δενδριμερούς, καταφέρνει να διασχίσει την λιπιδική διπλοστοιβάδα