Μελέτη και βιολογική αξιολόγηση ραδιοεπισημασμένων πεπτιδικών παραγώγων μπομπεσίνης

Abstract

Bombesin (BN) is a 14-amino acid neuropeptide with high affinity and specificity for the gastrin-releasing-peptide (GRP) receptors. Specific receptors for BN are expressed on a variety of human tumors including prostate, gastric, colon, breast, lung and pancreatic cancers. Aim of the present study is the evaluation of the 99mTc-complexes of the two following new Bombesin (BN)-like peptides: Gly-Gly-Cys-Aca-BN[2-14], (BN1.1), and Gly-Gly-Cys-Aca-BN[7-14] (BN1.1p), where Aca: 6-amino-hexanoic acid. Pyroglutamic acid in the bombesin molecule has been replaced by the chemical moiety Gly-Gly-Cys-Aca, which bears an amino-acid combination capable of complexing radiometals. The new BN derivatives were synthesized according to the SPPS method, purified and characterized by analytical methods. The complexes 185/187Re-BN-1.1 and 185/187Re-BN-1.1p were formed via the precursor rhenium gluconate and were identified by analytical methods. 99mTc-labeling was performed via the precursor 99mTc-gluconate. Chromatographic analysis showed for both derivatives that 99mTc-labeling led to the formation of a single radioactive species in high yield (>98%). The stability of the radiolabeled derivatives obtained was examined with time and in human plasma. Metabolic studies were performed in kidney and liver homogenates. Both 99mTc-BN1.1 and 99mTc-BN1.1p were practically stable with time and in human plasma, whereas they degraded rapidly in kidney and liver homogenates, as indicated by metabolic studies. IC50 values were determined, comparatively, for the BN-derivatives, the respective185/187Re complexes and Tyr4-BN. Both unlabeled and labeled peptides demonstrated high binding affinity for the human prostate adenocarcinoma PC-3 cell line, which over-expresses bombesin receptors. Internalization was investigated in PC-3 cells at 37 0C. The degree of the residualization of 99mTc into the cells was examined with time. The rate of internalization of the labeled peptides was found to be time-dependent. Despite this high internalization rate, there was no longer-term retention of radioactivity in the cells. Tissue distribution of the radiopeptides was evaluated in normal mice and in prostate cancer experimental models. Significant uptake of radioactivity was observed in the pancreas of normal mice. Receptor-blocking studies with native BN confirmed the specificity of 99mTc-BN1.1 and 99mTc-BN1.1p toward the GRP receptors. Excretion took place mainly via the urinary system for 99mTc-BN1.1 and through the hepatobiliary tract in the case of 99mTc-BN1.1p. Satisfactory tumor images were obtained with both radiolabeled peptides. The above preliminary results indicate that these new Bombesin derivatives are promising for human cancer detection.

Η μπομπεσίνη (BN) είναι ένα δεκατετραπεπτίδιο που παρουσιάζει μεγάλη συγγένεια και εξειδίκευση για τους υποδοχείς του πεπτιδίου απελευθέρωσης της γαστρίνης (GRP). Υποδοχείς ειδικοί για την μπομπεσίνη εκφράζονται σε πολλούς ανθρώπινους καρκινικούς όγκους, όπως για παράδειγμα σε καρκίνο του προστάτη, του παχέος εντέρου, του μαστού, των πνευμόνων, καθώς και σε καρκίνο του παγκρέατος. Σκοπός της παρούσας εργασίας είναι η μελέτη δυο νέων πεπτιδικών παραγώγων της μπομπεσίνης επισημασμένων με 99mTc. Η αμινοξική αλληλουχία των νέων αυτών πεπτιδικών παραγώγων είναι: Gly-Gly-Cys-Aca-BN[2-14], (BN1.1) και Gly-Gly-Cys-Aca-BN[7-14] (BN1.1p), όπου Aca: το 6-άμινο εξανονοϊκο οξύ. Το πυρογλουταμικό οξύ στο μόριο της μπομπεσίνης έχει αντικατασταθεί και στις δυο περιπτώσεις από την αλληλουχία αμινοξέων Gly-Gly-Cys-Aca, η οποία διαθέτει κατάλληλα άτομα δότες για την σύμπλεξη με ραδιομέταλλα. Η σύνθεση των νέων πεπτιδικών παραγώγων πραγματοποιήθηκε σε στερεά φάση (SPPS) και ο καθαρισμός-χαρακτηρισμός τους έγινε με αναλυτικές μεθόδους. Ο σχηματισμός των συμπλόκων 185/187Re-BN-1.1 και 185/187Re-BN-1.1p έγινε μέσω του προδρόμου συμπλόκου γλυκονικό-ρήνιο και ο χαρακτηρισμός του πραγματοποιήθηκε με αναλυτικές μεθόδους. Η επισήμανση τους με 99mTc έγινε μέσω του προδρόμου συμπλόκου γλυκονικό-99mTc και οδήγησε στο σχηματισμό ενός μόνο επισημασμένου παραγώγου, σε κάθε περίπτωση, με ποσοστό επισήμανσης >98%. Η σταθερότητα των επισημασμένων προϊόντων εξετάσθηκε με την πάροδο του χρόνου, καθώς και σε παρουσία ανθρώπινου πλάσματος. Μεταβολικές μελέτες πραγματοποιήθηκαν σε ομογενοποίημα νεφρών και ήπατος. Τα 99mTc-BN1.1 και 99mTc-BN1.1p είναι πρακτικά σταθερά με τον χρόνο, καθώς και σε παρουσία ανθρώπινου πλάσματος, ενώ αποικοδομούνται ταχύτατα σε ομογενοποίημα νεφρών και ήπατος. Υπολογίστηκαν οι τιμές IC50 των νέων πεπτιδίων, καθώς και των συμπλόκων τους με 185/187Re, συγκριτικά με την Tyr4-BN. Τόσο τα πεπτίδια όσο και τα σύμπλοκά τους με 185/187Re παρουσιάζουν μεγάλη συγγένεια για τους υποδοχείς της μπομπεσίνης. Πραγματοποιήθηκαν μελέτες εσωτερικοποίησης και ελευθέρωσης του 99mTc, χρησιμοποιώντας την καρκινική σειρά PC-3, στους 37 0C. Ο βαθμός εσωτερικοποίησης των επισημασμένων πεπτιδίων στα καρκινικά κύτταρα εξαρτάται από τον χρόνο. Παρόλο που τα επισημασμένα πεπτίδια εσωτερικοποιούνται σε μεγάλο ποσοστό δεν παρατηρείται διατήρηση της ραδιενέργειας μέσα στα καρκινικά κύτταρα για μεγάλο χρονικό διάστημα. Μελέτες βιοκατανομής των επισημασμένων πεπτιδίων πραγματοποιήθηκαν σε φυσιολογικά πειραματόζωα και παθολογικά πρότυπα καρκίνου του προστάτη. Σημαντικό ποσοστό πρόσληψης της ραδιενέργειας παρατηρείται στο πάγκρεας των φυσιολογικών πειραματόζωων. Πειράματα ταυτόχρονης χορήγησης φυσικής μπομπεσίνης και 99mTc-BN1.1 και 99mTc-BN1.1p επιβεβαίωσαν την εξειδίκευση των ραδιοπεπτιδίων για τους υποδοχείς του GRP. Η αποβολή έγινε κυρίως από το ουροποιητικό σύστημα για το 99mTc-BN1.1, ενώ από το ηπατοχολοκό στην περίπτωση του 99mTc-BN1.1p. Ικανοποιητικές απεικονίσεις των όγκων λήφθηκαν και στις δυο περιπτώσεις των επισημασμένων πεπτιδίων. Τα παραπάνω αρχικά αποτελέσματα δείχνουν ότι τα δυο αυτά νέα παράγωγα της μπομπεσίνης είναι πολλά υποσχόμενα ως διαγνωστικά ραδιοφάρμακα.