Ιντεγκρινο-εξαρτώμενη ρύθμιση κολλαγονασών (MMPs) από την αμυλοειδική β πρωτεΐνη: πιθανός ρόλος της κολλαγονάσης B (MMP-9) στον μεταβολισμό της πρόδρομης πρωτεΐνης του αμυλοειδούς (APP)

Abstract

Alzheimer’s disease (AD) is a progressive neurodegenerative disorder characterized by the presence of brain amyloid plaques, composed mostly of amyloid beta peptides (Αβ40-42), generated by proteolytic processing of amyloid precursor protein (APP). Cleavage of APP by α-secretases within the Aβ sequence results in the secretion of a soluble N-terminal APP fragment (sAPPa) and generation of a membrane-bound COOH terminal fragment (CTF). This processing does not result in Aβ formation. However, cleavage by β- and γ-secretases generates Aβ peptides and an ectodomain derivative (sAPPβ). Two subclasses of the metalloproteinase family of proteases, matrix metalloproteinases (MMPs) and their close relatives a disintegrin and metalloprotease (ADAMs) have been implicated in receptor shedding including APP. MDC9, ADAM 10 and TACE, members of the ADAM family of proteases, have been shown to have a-secretase activity. However, the role of metalloproteinases in the pathogenesis of AD is not clear, even though several investigators reported that these enzymes might be involved in Aβ clearance. Elevated levels of MMPs in particular MMP-9 have been reported in the cortex and hippocampus of AD patients relative to control individuals. In the hippocampus of AD patients, increased immunoreactivity of the inactive form of MMP-9 was observed around the plaques, whereas, a very recent report stated that activated astrocytes surrounding amyloid plaques, showed enhanced expression of MMP-2 and MMP-9 in aged APP/presinilin 1 mice. Furthermore, active matrix metalloproteinase 9 (MMP-9) has been reported to degrade in vitro synthetic Aβ(1-40) at the α-secretase cleavage site between Lys 16-Leu 17 and amyloid beta fibrils. These observations have correlated increased expression especially of MMP-9, with AD. To address the mechanism of enhanced MMP-2 and MMP-9 secretion in the presence of Aβ we examined the possible role of integrins, since these receptors mediate at least in part the expression of MMPs. First we examined the effect of Aβ on MMP secretion in the human neuroblastoma cell line (SK-N-SH) as a neuronal cell model, providing evidence that neuronal cells as well as glial cells secrete increased levels of MMP-2 and MMP-9 in the presence of Aβ. Assays inhibiting the binding of these cells to solid-phase Aβ(1-40) were performed, in the presence of anti-integrin antibodies against the major integrins of these cells. These assays indicated that α₃β₁ and α₂β₁ integrin receptors mediated binding of SK-N-SH cells to Αβ(1-40). Additionally, using anti-a3, anti-β1 and anti-a2 monoclonal antibodies as ligands for the α₂β₁ and α₃β₁ integrins, lead to a vast increase of secreted MMPs especially MMP-9, indicating that α₃β₁ and α₂β₁ integrin receptors modulate the expression of these enzymes following cell binding to Aβ (1-40) substrate. To provide evidence regarding the possible role of MMP-9 in AD, we examined the role of MMP-9 on APP processing. We used MMP-9-transfected cells which over-express APP695 (HEK/APP695) to address the hypothesis that MMP-9, in addition to cleaving Aβ, also participates in processing intact, cell surface APP. Our experiments demonstrate that transfection-induced expression of MMP-9, or MMP-9 exogenously added to HEK/APP695 cells which normally secrete negligible amounts of this enzyme, markedly enhanced constitutive shedding of APP and decreased secretion of Aβ (1-40): APP immunoprecipitated on agarose G beads and exposed to exogenous activated MMP-9, released increased amounts of the soluble sAPPa fragment, indicating direct proteolytic cleavage of APP by this enzyme. Moreover, transfection-induced expression of human MMP-9 by HEK/APP695 cells (HEK/APP695/MMP-9) resulted in increased protein kinase C-stimulated secretion of sAPPa, suggesting that MMP-9 was involved in receptor-mediated sAPPa release. The observation that activation of protein kinase C with phorbol esters did not alter the levels of cellular APP, further suggests that increased levels of sAPPa were the result of increased MMP-9-mediated processing of APP. In several types of cultured cells inactive pro-MMP-9 co-exists with potential pro-MMP-9 activators. The mechanisms involved in activation of the secreted enzyme are not fully understood. It has been suggested that secreted pro-MMP-9 interacts with cell surface components which serve as docking molecules. Activation is then triggered by other proteases leading to proteolytic cleavage of the extracellular domain of the docking molecule and release (shedding) of this domain from the cell surface. According to this hypothesis, APP could be a candidate docking molecule for MMP-9, hence we examined whether APP associates with MMP-9. Immunoprecipitation and confocal microscopy experiments demonstrated that APP co-precipitated and co-localized with the latent (inactive) form of MMP-9 on the cell surface. Surface bound-latent, 92kDa-MMP-9 could be cleaved to form the active 88kDa-MMP-9 by intermediate activators, and enabled to shed cell surface APP. In conclusion, our data suggest a possible regulating mechanism according to which exposure of SK-N-SH cells to increased concentration of Aβ peptide results in increased expression of both MMP-2 and MMP-9. Up regulation of these enzymes is mediated at least in part via α₃β₁ and α₂β₁ integrin receptors. Association of latent MMP-9 with APP on the cell surface could trigger the activation of the latent MMP-9 to the active form by intermediate activators leading to proteolytic cleavage of the docking molecule (APP), in a manner similar to a secretase, precluding thus the formation of aggregating Aβ. Based on these findings we hypothesize that MMP-9 forms part of a neuroprotective, partly integrin-mediated shedding of APP.

Η νόσος Alzheimer (AD) είναι μια προοδευτικά εξελισσόμενη νευροεκφυλιστική διαταραχή, που χαρακτηρίζεται από την συσσώρευση των αμυλοειδικών πλακών στην περιοχή του εγκεφάλου. Το κύριο συστατικό των αμυλοειδικών πλακών είναι πεπτίδια β αμυλοειδούς πρωτεΐνης (Αβ -40, -42), τα οποία παράγονται κατά την πρωτεολυτική αποικοδόμηση της πρόδρομης αμυλοειδικής πρωτεΐνης (ΑΡΡ). Η πρωτεολυτική αποικοδόμηση της ΑΡΡ από α-εκκριτάσες εντός της αμινοξικής αλληλουχίας του Αβ πεπτιδίου, έχει ως αποτέλεσμα την απελευθέρωση του διαλυτού αμινοτελικού άκρου της ΑΡΡ (sAPPα), και την δημιουργία του μεμβρανο-συνδεόμενου καρβόξυ-τελικού άκρου της ΑΡΡ (CTF). Η συγκεκριμένη πρωτεολυτική διαδικασία μπορεί να εμποδίσει την παραγωγή του Αβ πεπτιδίου. Αντίθετα, η πρωτεολυτική αποικοδόμηση από β- και γ-εκκριτάσες, οδηγεί στην παραγωγή του Αβ πεπτιδίου, και την έκκριση του αμινοτελικού παράγωγου (sAPPβ). Δύο υπο-κατηγορίες της ευρύτερης οικογένειας των μεταλλοπρωτεασών, οι μεταλλοπρωτεάσες της εξωκυττάριας ουσίας (MMPs) και οι δισιντεγκρίνες ή αδαμαλυσίνες (ADAMs) εμπλέκονται στην πρωτεολυτική πέψη διαφόρων μεμβρανικών μορίων μεταξύ των οποίων και η ΑΡΡ. Συγκεκριμένα οι αδαμαλυσίνες ADAM-9, -10 και -17 (MDC9, ADAM 10 και TACE) έχει δειχθεί να έχουν δραστικότητα α-εκκριτάσης. Όσον αφορά τις MMPs, ο ρόλος τους στην παθογένεια της νόσου δεν έχει εξακριβωθεί πλήρως αν και αρκετές μελέτες σχετίζουν την ενεργότητα τους με τον καταβολισμό του Αβ πεπτιδίου. Αυξημένα επίπεδα έκφρασης κυρίως των ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 έχουν εντοπισθεί στον φλοιό ιππόκαμπου ασθενών με AD ενώ, χαρακτηριστική, είναι η υψηλή ανοσοδραστικότητα που εμφανίζει η πρόδρομη μορφή της ΜΜΡ-9 σε περιοχές γύρω των αμυλοειδών πλακών. Επιπλέον, η ενεργοποιημένη μορφή της ΜΜΡ-9 έχει την ικανότητα να πρωτεολύει, τόσο συνθετικά ανάλογα Αβ πεπτιδίου στην χαρακτηριστική θέση πρωτεόλυσης των α-εκκριτασών (Lys16-Leu17), όσο και ινιδίων πολυμερισμένου Αβ πεπτιδίου. Οι παρατηρήσεις αυτές συσχετίζουν άμεσα την αυξημένη έκφραση κυρίως της ΜΜΡ-9 με την νόσο AD, καθιστώντας πιθανή την υπόθεση συμμετοχής της στον μεταβολισμό της ΑΡΡ. Για να εξετάσουμε τον μηχανισμό της διαφοροποιημένης έκφρασης των ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 που παρατηρείται σε παθολογικές καταστάσεις AD, μελετήσαμε τον πιθανό ρόλο των ιντεγκρινών, στην διαμεσολάβηση της έκφρασης των πιο πάνω μορίων, δεδομένου οι συγκεκριμένοι υποδοχείς ρυθμίζουν, τουλάχιστον εν μέρει, την έκφραση των MMPs. Ως σύστημα μελέτης χρησιμοποιήθηκε η ανθρώπινη νευροβλαστική σειρά SK-N-SH, σαν μοντέλο νευρικών κυττάρων. Αρχικά, προσδιορίστηκε η επίδραση του Αβ πεπτιδίου στην έκφραση των ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 στην συγκεκριμένη κυτταρική σειρά, όπου δείχτηκε ότι τα νευρικά κύτταρα όπως και τα νευρογλοιακά εκκρίνουν αυξημένη ποσότητα των δύο ενζύμων παρουσία Αβ. Με πειράματα αναστολής της κυτταρικής προσκόλλησης, σε ακινητοποιημένο Αβ πεπτίδιο, και την χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων έναντι ιντεγκρινικών υποδοχέων προέκυψε ότι οι ιντεγκρινικοί υποδοχείς α₃β₁ και α₂β₁ μεσολαβούν στην αλληλεπίδραση των SK-N-SH κυττάρων με το Αβ πεπτίδιο. Χρησιμοποίηση των μονοκλωνικών αντισωμάτων έναντι των α3 , α2 και β1 ιντεγκρινικών υπομονάδων, ως προσδέτες των αντίστοιχων ιντεγκρινών σε κύτταρα SK-N-SH, προκάλεσαν σημαντική αύξηση στα εκκρινόμενα επίπεδα των ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 υποδεικνύοντας ότι οι συγκεκριμένες ιντεγκρίνες διαμεσολαβούν στην διαφοροποιημένη έκφραση των ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 παρουσία του Αβ πεπτιδίου. Παράλληλα μελετήσαμε και την επίδραση της ΜΜΡ-9 στον μεταβολισμό της ΑΡΡ. Η υπερέκφραση της πρόδρομης μορφής της ΜΜΡ-9 σε μετασχηματισμένα κύτταρα ΗΕΚ-293 που εκφράζουν σταθερά την ισομορφή ΑΡΡ695, όπως επίσης και η επίδραση ανασυνδιασμένης/ενεργοποιημένης ΜΜΡ-9 στα παραπάνω κύτταρα εξωγενώς, προκάλεσε αυξημένη έκκριση του διαλυτού θραύσματος (sAPPa) και μείωση του εκκρινόμενου Αβ πεπτιδίου. Με in vitro πειράματα πιστοποιήθηκε ότι η απελευθέρωση του διαλυτού θραύσματος sAPPa οφείλετε στην αποικοδόμηση του ανέπαφου μορίου της ΑΡΡ από την ΜΜΡ-9. Η αυξημένη παραγωγή του sAPPa στο υλικό καλλιέργειας των ΗΕΚ/ΑΡΡ695 κυττάρων, η οποία οφείλεται στην υπερέκφραση της ΜΜΡ-9, ενισχύεται παρουσία φορβολικού εστέρα (ενεργοποιητή α-εκκριτασών) μέσω της PKC. Η παρατήρηση ότι η ενεργοποίηση της πρωτεϊνικής κινάσης C με τον φορβολικό εστέρα δεν επηρέασε τα ενδογενή επίπεδα έκφρασης της ΑΡΡ, υποδεικνύει ότι τα αυξημένα επίπεδα του sAPPa ήταν αποτέλεσμα της αυξημένης ενεργότητας της ΜΜΡ-9 στον μεταβολισμό της ΑΡΡ. Σε πολλές κυτταρικές σειρές η εκκρινόμενη ΜΜΡ-9, ακόμη και παρουσία δυναμικών ενεργοποιητών της, εντοπίζεται σε πρόδρομη μορφή. Η διαδικασία ενεργοποίησης της δεν έχει διαλευκανθεί πλήρως, ωστόσο προτείνεται ένας μηχανισμός σύμφωνα με τον οποίο, μπορεί να αλληλεπιδρά με μόρια της κυτταρικής επιφάνειας. Η αλληλεπίδραση αυτή μπορεί να είναι λειτουργική καθώς με τον τρόπο αυτό πιθανόν να επιτυγχάνεται η ενεργοποίηση του ενζύμου και εν’ συνεχεία η πρωτεολυτική πέψη του μορίου αγκυροβόλησης. Σύμφωνα με την παραπάνω υπόθεση η ΑΡΡ θα μπορούσε να αποτελεί ένα μόριο αγκυροβόλησης της ΜΜΡ-9. Με πειράματα ανοσοκατακρήμνισης αλλά και συνεστιακής μικροσκοπίας ανοσοφθορισμού αποδείχτηκε ότι η pro-MMP-9 και η ΑΡΡ αλληλεπιδρούν στην κυτταρική επιφάνεια. Η αλληλεπίδραση αυτή μπορεί να είναι λειτουργική καθώς με τον τρόπο αυτό, πιθανόν, επιτυγχάνεται η ενεργοποίηση του ενζύμου και εν’ συνεχεία η πρωτεολυτική πέψη της ΑΡΡ. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα περιγράφουν έναν πιθανό ρυθμιστικό μηχανισμό σύμφωνα με τον οποίο η αυξημένη συγκέντρωση Αβ πεπτιδίου, κύριο χαρακτηριστικό της νόσου Alzheimer, επάγει τροποποιήσεις στην έκφραση των μεταλλοπρωτεασών κυρίως της ΜΜΡ-9, εν μέρη, μέσω των αλληλεπιδράσεων του με τους ιντεγκρινικούς υποδοχείς α₃β₁ και α₂β₁. Η προκληθείσα, από το Αβ πεπτίδιο, αυξημένη έκκριση της ΜΜΡ-9 εν συνεχεία, μέσω της αλληλεπίδρασης της με την ΑΡΡ στην κυτταρική επιφάνεια μπορεί να προκαλέσει τον μεταβολισμό της τελευταίας, κατά τρόπο παρόμοιο με αυτόν των α-εκκριτασών εμποδίζοντας έτσι την παραγωγή του Αβ πεπτιδίου, και παράλληλα ενισχύοντας την έκκριση του νευροπροστατευτικού θραύσματος sAPPa.