Η ανίχνευση μελανοκυττάρων στο περιφερικό αίμα ως δείκτης παρακλούθησης ασθενών με μελάνωμα υψηλού κινδύνου υπό θεραπεία με ιντερφερόνη

Abstract

During the last decades the incidence of malignant melanoma steadily increases and the need for markers in detection of early metastasis and guidance of therapy has become urgent. Presence of melanoma cells in peripheral blood could indicate dissemination in the circulation, and thus a high risk of metastasis. For detecting tumor cells in melanoma patients RT-PCR has been used to identify expression of tyrosinase a key enzyme in melanin biosynthesis, in the circulation of melanoma patients. To address the prognostic implications of the presence of circulating melanoma cells we investigated the presence of tyrosinase mRNA by RT-PCR in the peripheral blood of stage IIB and III melanoma patients on high dose adjuvant interferon alpha-2β at multiple sequential time points from initiation of treatment. Total RNA was isolated from the mononuclear cell fraction of peripheral blood, and after reverse transcription, cDNA samples were amplified by nested PCR. Results were confirmed by Southern blotting and hybridization with radiolabeled probe. The sensitivity of the assay was determined by serial dilution of SK-mel28 melanoma cells and was high enough to detect 1 SK-mel28 cell in 10⁷ mononuclear cells, after Southern blotting and autoradiography. Four hundred eighty-eight blood samples from sixty melanoma patients were tested for tyrosinase expression. The correlation between relapse and RT-PCR results was evaluated by the x² test. Relapse-free and overall survival were analysed by the Kaplan-Meir method. Positive RT-PCR result during follow-up was the only prognostic factor that significantly correlated with higher risk of relapse. Our data suggest that circulating melanoma cells are markers of high relapse risk and shorter disease-free survival. Tyrosinase mRNA amplification by RT-PCR may be a useful tool for monitoring the efficacy of adjuvant treatment in stage IIB and III melanoma patients.

Κατά τις τελευταίες δεκαετίες οι περιπτώσεις κακοήθους μελανώματος αυξάνονται σταθερά και υπάρχει άμεση ανάγκη να βρεθούν βιολογικοί παράγοντας ικανοί να δώσουν προγνωστικά στοιχεία για την κλινική συμπεριφορά της νόσου και τη βελτίωση της θεραπευτικής αντιμετώπισης της. Παρουσία κυττάρων μελανώματος σε δείγματα περιφερικού αίματος, θα μπορούσε να υποδηλώνει αυξημένο κίνδυνο υποτροπής. Προκειμένου να εξεταστεί η προγνωστική σημασία της παρουσίας κυκλοφορούντων στο περιφερικό αίμα μελανοκυττάρων, κατά την παρούσα εργασία μελετήθηκε η παρουσία του μεταγραφήματος του γονιδίου της τυροσινάσης, ενός σημαντικού ενζύμου της βιοσυνθετικής οδού της μελανίνης, με την τεχνική της Αλυσιδωτής Αντίδρασης Πολυμεράσης Αντίστροφης μεταγραφής (RT-PCR) στο περιφερικό αίμα ασθενών κλινικού σταδίου IIB και III, οι οποίοι βρίσκονταν υπό θεραπεία με υψηλή δόση ενισχυτικής ιντερφερόνης άλφα-2β, σε διαδοχικάχρονικά στάδια από την έναρξη της θεραπείας. Ολικό RNA απομονώθηκε από το κλάσμα των λευκοκυττάρων του περιφερικού αίματος, και ακολούθησε αντίστροφη μεταγραφή και ενίσχυση του cDNA με nested PCR. Τα αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν με μεταφορά κατά Southern και υβριδισμό με ραδιενεργό ανιχνευτή. Η ευαισθησία της μεθόδου ελέγχθηκε με διαδοχικές αραιώσεις μελανοκυττάρων της κυτταρικής σειράς SK-mel28 και βρέθηκε ικανή να ανιχνεύει 1 SK-mel28 κύτταρο σε 10⁷ λευκοκύτταρα, μετά από μεταφορά κατά Southern και αυτοραδιογραφία. Τετρακόσια δέκα οκτώ δείγματα από εξήντα ασθενείς ελέγχθηκαν για έκφραση του γονιδίου της τυροσινάσης. Η δοκιμασία x² χρησιμοποιήθηκε για την εκτίμηση της συσχέτισης υποτροπής και αποτελεσμάτων της RT-PCR. Το ελεύθερο νόσου διάστημα καθώς και το ολικό διάστημα επιβίωσης αναλύθηκαν με τη μέθοδο Kaplan-Meir. Μία ή περισσότερες θετικές RT-PCRs κατά τη διάρκεια παρακολούθησης ήταν ο μόνος παράγοντας που βρέθηκε πως σχετίζεται στατιστικώς σημαντικά με μικρότερο διάστημα άνευ νόσουεπιβίωσης. Τα ευρήματα μας συνηγορούν πως η παρουσία κυκλοφορούντων μελανοκυττάρων είναι δείκτης υψηλού κινδύνου υποτροπής και βραχύτερης άνευ νόσου επιβίωσης. Η ενίσχυση του μεταγραφήματος της τυροσινάσης με τη μέθοδο της RT-PCR μπορεί να είναι ένα χρήσιμο εργαλείο για την εκτίμηση της αποτελεσματικότητας της συμπληρωματικής θεραπείας σε ασθενείς με μελάνωμα κλινικού σταδίου IIB και III.