Βιοχημική μελέτη κυτταροπλασματικών πολυπεπτιδίων στον καρκίνο στομάχου

Abstract

The aim of this study is the analysis of cytoplasmic polypeptides in cancerous and non-cancerous stomach tissues using high-resolution two- dimensional electrophoresis which is widely used with the purpose of developing tumor markers, as well as their correlation with pathological markers. A total of 166 stomach tissues coming from 83 patients were surgically obtained at the Surgical Department of the Hippocration Hospital, Athens, over a period of 6 years (1996-2002). Seventy-seven of the specimens were histologically diagnosed as primary adenocarcinomas, 83 specimens represented mirror biopsies from each patient, 2 were peptic ulcer, 2 were atrophic gastritis, 2 were non-Hodgkin lymphoma. After the technique has been applied to all samples, further analysis of the polypeptides was carried out, based on differences in their molecular weight and isoelectric point properties. The polypeptides were visualized on 2D gel preparations by silver staining and the measurement of their concentration was conducted using densitometer and specialized software programs. Significant qualitative and quantitative polypeptide differences were noted between cancerous and non-cancerous samples comparing each cancer tissue sample with the respective mirror biopsy of the same patient. Six polypeptides (MW/PI) Pa (46/3.3), Pb (46/2.8), Pc (46/2.6), Pk (40/4.2), P^ (40/4.0), Pm (40/3.8), were detected in all mirror biopsy tissues and not detected in the majority of adenocarcinomas. In addition to the above significant qualitative differences, quantitative differences in polypeptide concentration were also observed, highlighting 18 polypeptides significantly altered in malignant specimens. Fourteen polypeptides were significantly increased in tumour samples while four polypeptides were observed to be decreased in malignant specimens. The above changes in cytoplasmic polypeptides may occur as a result of the arrest the normal cell differentiation or the changes in cell-cycle that took place during carcinogenesis. The polyptides P5 (27/6.2), P6 (26/6.0), PI8 (15/5.3) were also detected and may correspond to the antioxidants glutathione-S-transferase, peroxiredoxin and thioredoxin, respectively. The study of the pattern of lymphoma and atrophic gastritis provide their similarity with those of adenocarcinomas, while the pattern derived from peptic ulcer is similar to those of non-cancerous samples. The study of the polypeptide expression and its correlation with clinical and pathologoanatomic parameters showed that the polypeptide expression is associated with the development of gastric cancer, especially as far as they concern aggressive, infiltrating tumor with lymph nodes metastasis. The multifactor analysis indicate polypeptides P4, PI6 as independent prognostic factors and significant biomarkers of poor prognosis. The correlation between the polypeptide expression and significant prognostic factors highlighted statistical significant polypeptides. Therefore, further molecular analysis of these polypeptides may provide to the direction of developing tumor markers of stomach.

Ο σκοπός αυτής της διατριβής είναι η μελέτη της έκφρασης των κυτταροπλασματικών πολυπεπτιδίων σε καρκινικούς και μη καρκινικούς ιστούς στομάχου εφαρμόζοντας την τεχνική της ηλεκτροφόρησης δύο διαστάσεων που ευρέως χρησιμοποιείται για την ανίχνευση καρκινικών δεικτών, καθώς και η μελέτη των συσχετίσεων των πολυπεπτιδίων με τους κλασσικούς ιστοπαθολογικούς δείκτες. Για τη μελέτη αυτή χρησιμοποιήθηκαν 166 εγχειρητικά παρασκευάσματα από 83 ασθενείς, τα οποία συγκεντρώθηκαν κατά την χρονική περίοδο 1996-2002, από τα οποία 77 προέρχονταν από αδενοκαρκίνωμα στομάχου, 83 ήταν μη παθολογικοί ιστοί (βιοψία καθρέπτη), 2 από γαστρικό έλκος, 2 από ατροφική γαστρίτιδα με επιθηλιακή δυσπλασία, 2 από λέμφωμα υψηλής κακοήθειας, μη Hodgkin. Αφού εφαρμοστεί η τεχνική της ηλεκτροφόρησης δύο διαστάσεων σε όλα τα δείγματα όπυ γίνεται διαχωρισμός των πολυπεπτιδίων ανάλογα το μοριακό τους βάρος (MB) και το ισοηλεκτρικό σημείο (ΙΣ), τα ηλεκτροφορήματα βάφονται με την μέθοδο του νιτρικού αργύρου και ακολουθεί επεξεργασία τους μέσω πυκνομέτρου και εξειδικευμένου λογισμικού προγράμματος. Η σύγκριση των ηλεκτροφορημάτων που προέρχονται από καρκινικά και μη καρκινικά δείγματα ιστών στομάχου, ανέδειξε σημαντικές διαφορές στην ποιοτική και ποσοτική έκφραση των κυτταροπλασματικών πολυπεπτιδίων με την ανάπτυξη της κακοήθειας. Εντοπίστηκαν 6 πολυπεπτίδια με ΜΒ/ΙΣ , το na (46/3.3), Πό (46/2.8), Πο (46/2.6) nk (40/4.2), Π1 (40/4.0), Ππι (40/3.8), τα οποία ανιχνεύονται στους ιστούς από βιοψία καθρέπτη αλλά απουσιάζουν στην πλειοψηφία των αδενοκαρκινωμάτων ή εντοπίζονται ασθενώς σε μικρό ποσοστό των αδενοκαρκινωμάτων. Επίσης, ανιχνεύθηκαν 18 πολυπεπτίδια που η μεταβολή της συγκέντρωσης τους κρίθηκε στατιστκά σημαντική. Συγκεκριμένα, 14 πολυπεπτίδια αυξάνουν την συγκέντρωση τους και 4 την ελαττώνουν στα αδενοκαρκινώματα στομάχου σε σχέση με τους μη παθολογικούς ιστούς. Οι μεταβολές αυτές της έκφρασης των πολυπεπτιδίων που παρατηρούνται κατά την καρκινογένεση είναι πιθανόν αποτέλεσμα της διακοπής της φυσιολογικής διαφοροποίησης των κυττάρων και των αλλαγών του κυτταρικού τους κύκλου. Κατά την μελέτη των ηλεκτροφορημάτων, εντοπίστηκαν τα πολυπεπτίδια Π5 (27/6.2), ELj (26/6.0), Π)8 (15/5.3) που αντιστοιχούν στις αντι-οξειδωτικές ουσίες GSH-S-τρανσφεράση, peroxiredoxine-2, και θειορεντοξίνη αντίστοιχα. Επιπρόσθετα, μελετήθηκαν περιπτώσεις λεμφώματος, γαστρικού έλκους και ατροφικής γαστρίτιδας και αναδείχθηκαν οι ομοιότητες που υπάρχουν μεταξύ του λεμφώματος, ατροφικής γαστρίτιδας και καρκινικών ιστών καθώς και η ομοιότητα του γαστρικού έλκους με μη καρκινικούς ιστούς. Τέλος, μελετήθηκε η έκφραση των πολυπεπτιδίων σε σχέση με ορισμένες κλινικές και παθολογοανατομικές παραμέτρους και διαπιστώθηκε ότι η μεταβολή της συγκέντρωσης αρκετών πολυπεπτιδίων έχει σημαντικό ρόλο στην πορεία ανάπτυξης των όγκων στο στομάχι και μάλιστα σε ιδιαίτερα διηθητικούς όγκους με αυξημένη ικανότητα για μεταστάσεις στους λεμφαδένες. Η πολυπαραγοντική ανάλυση ανέδειξε τα πολυπεπτίδια Π4 και Π)6 ως ανεξάρτητους προγνωστικούς παράγοντες στη βιολογική συμπεριφορά των αδενοκαρκινωμάτων στομάχου και ως δείκτες δυσμενούς πρόγνωσης της νόσου. Οι συσχετίσεις της έκφρασης των πολυπεπτιδίων και σημαντικών προγνωστικών παραμέτρων αναδεικνύουν αρκετά στατιστικά σημαντικά πολυπεπτίδια που η περαιτέρω ανάλυση τους με τεχνικές μοριακής βιολογίας θα συμβάλει στην πληρέστερη κατανόηση του ρόλου τους κατά την ανάπτυξη του όγκου και πιθανόν να οδηγήσουν στην ανάδειξη καρκινικών δεικτών στομάχου.