Συγκριτική μελέτη των ISO καλλιεργητικών μεθόδων και των μοριακών μεθόδων PCR και RT-PCR στην ανίχνευση Listeria monocytogenes από τρόφιμα

Abstract

Listeria monocytogenes has been isolated from humans, environmental samples and a variety of foods. Epidemiological investigations following major epidemics have shown that epidemic listeriosis is a foodborne disease. L. monocytogenes has been isolated from a variety of foods and from production lines of fresh and cold-smoked fish and thus seafood has been included as a potential source of Listeria infection in humans. The numbers of L. monocytogenes cells in foods, environmental and clinical samples are very small and the selection of appropriate methodology for the detection of the bacterium is very important. The objectives of the present research were:a) the comparative study of the standard cultural techniques and the modern molecular methods used for the detection of L. monocytogenes from food samples and b) the assessment of L. monocytogenes contamination of fish and the evaluation of standard ISO methods and modern molecular techniques. For the comparative study liquid cultures were inoculated with a suspension of L. monocytogenes with known standardized concentration. Consequently the presence of the microorganism was detected using the standard ISO cultural method (cultures onto Oxford agar and PALCAM agar) and the Polymerase Chain Reaction (PCR), employing two new automated PCR systems, the LightCycler (Roche) and the Bax (Qualicon). Serial dilutions of the initial inoculum of L. monocytogenes were examined in various concentrations and the experiment was repeated with samples subjected to pasteurization and sterilization. All experiments were performed induplicate. For the assessment of L. monocytogenes contamination of fish and the evaluation of standard ISO methods and modern molecular techniques 255 samples of fresh and marine water edible fish were examined using the ISO 11290-1 cultural method, the PCR and the Real Time PCR. The samples were collected from local fish markets and local aquacultures in Epirus, Northwestern Greece. Half-Fraser broth and Fraser broth were used for pre-enrichment and enrichment reciprocally, while Oxford agar and PALCAM agar (ISO 11290-1) were used as selective agars. The seven strains of L. monocytogenes (2,75%) were isolated by both the cultural techniques and the PCR systems. One strain of L. monocytogenes (serotype 4) (3,3%) was isolated from a fresh fish (cephalus) of local capture, two strains L. monocytogenes (serotype 1) (6,7%) were isolated from imported fresh salmon filet and four strains L. monocytogenes (serotype 1) (8,9%) were isolated from smoked rainbow trout. All isolates were susceptible to routinely used antibiotics, ampicilin and penicilin. The results suggest that the molecular methods are faster and more accurate compared to standard culture methods. L. monocytogenes can be detected in any food sample within two days, instead of the seven days needed when the cultural methods are employed. The results also indicate the possible risk of L. monocytogenes infection transmitted from fish to humans through inadequately cooked seafood meals and/or through contamination of culinary tools.

Η L. monocytogenes έχει απομονωθεί από κλινικά και περιβαλλοντικά δείγματα, καθώς και από δείγματα τροφίμων. Μελέτες που έχουν γίνει σε μεγάλες επιδημίες έχουν δείξει ότι η λιστερίωση είναι τροφιμογενές νόσημα. Η L. monocytogenes έχει απομονωθεί από ποικιλία τροφίμων, καθώς και από τις γραμμές παραγωγής κρύας ή θερμής κάπνισης ιχθύων, γι αυτό το λόγο τα ιχθυηρά είναιυπεύθυνα για περιπτώσεις ανθρώπινης λιστερίωσης. Οι αριθμοί των κυττάρων της L. monocytogenes από τα τρόφιμα, τα περιβαλλοντικά και κλινικά δείγματα είναι πολύ μικροί, γι αυτό είναι πολύ σημαντική η επιλογή της κατάλληλης μεθόδου για την ανίχνευση του βακτηρίου. Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν: α) η συγκριτική μελέτη ανίχνευσης της L. monocytogenes από τα τρόφιμα με τη χρήση της ISO 11290-1 καλλιεργητικής μεθόδου και των νέων μοριακών μεθόδων (PCR, Real Time PCR) και β) ο προσδιορισμός της συχνότητας απομόνωσης της L. monocytogenes σε ιχθυηρά της ελληνικής αγοράς, τόσο με τη χρήση κλασικών καλλιεργητικών υποστρωμάτων, όσο και νέων μοριακών τεχνικών. Για τη συγκριτική μελέτη, χρησιμοποιήθηκαν υγρά υποστρώματα, στα οποία ενοφθαλίστηκε πρότυπο στέλεχος L. monocytogenes γνωστής συγκέντρωσης. Για τηνανίχνευση του μικροοργανισμού χρησιμοποιήθηκε η ISO 11290-1 καλλιεργητική μέθοδος (σε Oxford άγαρ και σε PALCAM άγαρ) και η Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης (PCR), με χρήση δύο νέων αυτοματοποιημένων συστημάτων, του LightCycler (Roche) και του Bax® system (Qualicon). Εξετάστηκαν διαδοχικές αραιώσεις του αρχικού εναιωρήματος της L. monocytogenes και το πείραμαεπαναλήφθηκε με τα δείγματα να έχουν υποστεί νωρίτερα παστερίωση και αποστείρωση. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις διπλούν. Για τον προσδιορισμό της συχνότητας της L. monocytogenes στα ιχθυηρά, εξετάστηκαν 255 δείγματα νωπών και επεξεργασμένων ιχθύων, γλυκών και αλμυρών υδάτων, τόσο με τη χρήση των κλασικών καλλιεργητικών υποστρωμάτων (ISO11290-1), όσο και των δύο νέων μοριακών τεχνικών. Τα δείγματα συλλέχθηκαν από σούπερ μάρκετ, ιχθυοπωλεία και ιχθυοτροφεία της Ηπείρου. To Half-Fraser broth και το Fraser broth χρησιμοποιήθηκαν ως προ-εμπλουτιστικό και εμπλουτιστικό θρεπτικό μέσο αντίστοιχα, ενώ το Oxford άγαρ και το PALCAM άγαρ (ISO 11290-1) ως εκλεκτικά στερεά θρεπτικά υποστρώματα. Με τα καλλιεργητικά μέσα απομονώθηκαν επτά στελέχη L. monocytogenes (2,75%), τα οποία επίσης ανιχνεύθηκαν και από τα δύο μοριακά συστήματα PCR. Το ένα στέλεχος L. monocytogenes (ορότυπος 4) απομονώθηκε από ένα φρέσκο κέφαλο (3,3%), δύο στελέχη L. monocytogenes(ορότυπος 1) απομονώθηκαν από εισαγόμενα φιλέτα σολομού (Νορβηγίας) (6,7%) και τέσσερα στελέχη L. monocytogenes (ορότυπος 1) απομονώθηκαν από καπνιστές πέστροφες (8,9%). Όλα τα στελέχη ήταν ευαίσθητα στα αντιβιοτικά πενικιλίνη και αμπικιλίνη. Από τα αποτελέσματα φαίνεται ότι οι μοριακές τεχνικές είναι πιο γρήγορες και ακριβείς σε σχέση με την καλλιεργητική μέθοδο. Η ανίχνευση και ταυτοποίηση της L. monocytogenes μπορεί να γίνει σε δύο ημέρες σε σύγκριση με τιςκαλλιεργητικές τεχνικές που απαιτούν περίπου μία εβδομάδα. Από τα αποτέλεσμα φαίνεται επίσης ότι τα ιχθυηρά μπορούν να αποτελέσουν μέσο μετάδοσης της L. monocytogenes στον άνθρωπο, είτε μέσω κατανάλωσης μη κάλο μαγειρεμένων ιχθύων, είτε με επιμόλυνση από μαγειρικά σκεύη.