Διερεύνηση της σύστασης των λιπιδίων του πλάσματος ασθενών με διαταραχή του μεταβολισμού των λιποπρωτεϊνών με φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού πρωτονίου (¹H NMR)

Abstract

Plasma lipoproteins are macromolecular complexes of lipids and apolipoproteins. Alterations in the lipid composition and overall structure of lipoprotein particles accompanied dyslipidemia and have been associated with cardiovascular and renal disease and hypertension. Conventional methods for the analysis of lipoproteins are tedious and specific pre-selection of the experimental conditions is required. High-resolution nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is a noninvasive and nondestructive analytical technique for the study of lipoproteins. In the present was developed the methodology for the analysis of lipid composition of plasma lipoproteins with ¹H NMR spectroscopy and the application in dyslipidemia and coronary heart disease. In addition, pattern recognition techniques were applied in the ¹H NMR spectra of lipid extracts of these lipoproteins in order to construct statistical models able to approach the presence of CHD. Serum samples from a) 105 individuals with a broad spectrum of lipid levels, normal or pathological and after divided in three groups based on lipid levels: normolipidemic individuals, hypercholesterolemic patients and patients with mixed hyperlipidemia and b) 54 patients with severe triple vessel coronary heart disease (TVD) and 41 patients with angiographically normal coronary arteries (NCA). HDL lipoprotein particles were isolated from the nonHDL lipoproteins by precipitation with Dextran Sulfate/MGCL₂. ¹H NMR spectra were recorded on a Bruker Avance DRX-500 and DRX-600 spectrometer at temperature 298°Κ. In the first part of the thesis was studied the ¹H NMR spectrum of lipid extracts of HDL and nonHDL lipoproteins. In the second part selected individuals with a broad spectrum of lipid levels, calculated the % composition of HDL lipoproteins and was studied the influence of serum lipidemic parameters in their composition. In the third part, patients presented a broad spectrum of lipid levels divided in three groups and studied the alterations in the lipid composition of HDL and nonHDL lipoproteins. Moreover, studied the alterations in the lipid composition of HDL and nonHDL lipoproteins of patients with CHD. In the fourth part of the thesis, investigated the application of pattern recognition techniques to ¹H NMR spectra of lipid extracts of HDL and nonHDL lipoproteins in order to construct statistical models able to approach the presence of CHD. The OSC/PLS-DA statistical models which were able to predict CHD with a confidence limit >95%. The gender of patients, HDL-C and triglycerides levels did not influence the prediction of disease. In conclusion, the analysis of lipid composition of HDL and nonHDL lipid extracts with ¹H NMR spectroscopy in pathological situations will contribute to understanding better the pathophysiological mechanisms accompanied them. The collection of data from a large number of patients as well as the control of effect and other physiological or pathological factors would contribute to the creation of reliable data base concerning with CHD.

Οι λιποπρωτεϊνες του πλάσματος είναι μακρομοριακά συμπλέγματα λιπιδίων και απολιποπρωτεϊνών. Μεταβολές τις λιπιδιακής σύστασης και της συνολικής δομής των λιποπρωτεϊνικών σωματιδίων συνοδεύουν τη δυσλιπιδαιμία και έχουν συσχετισθεί με την καρδιαγγειακή και νεφρική νόσο και την υπέρταση. Οι καθιερωμένες τεχνικές για την ανάλυση των λιποπρωτεϊνών είναι αρκετά χρονοβόρες και απαιτούν προεργασία του δείγματος σε πολλά στάδια. Εναλλακτικά, η φασματοσκοπία ¹H NMR είναι μια μη επεμβατική αναλυτική τεχνική καθώς με μικρή ή καθόλου προεργασία του δείγματος, παρέχει μια γρήγορη και συνολική ανάλυση των λιπιδίων. Στην παρούσα διατριβή αναπτύχθηκε η μεθοδολογία για την ανάλυση της λιπιδιακής σύστασης των λιποπρωτεϊνών με φασματοσκοπία ¹H NMR και η εφαρμογή της στη δυσλιπιδαιμία και την εγκατεστημένη καρδιαγγειακή νόσο. Επίσης, εφαρμόστηκαν οι τεχνικές αναγνώρισης προτύπων στα ¹H NMR φάσματα των εκχυλισμάτων των λιπιδίων των λιποπρωτεϊνών με σκοπό τη δημιουργία στατιστικών μοντέλων ικανών να προσεγγίζουν την παρουσία της εγκατεστημένης καρδιαγγειακής νόσου. Για τη μελέτη αυτή επιλέχθηκαν α) 105 άτομα, τα επίπεδα λιπιδίων των οποίων κάλυπταν ένα ευρύ φάσμα φυσιολογικών και παθολογικών τιμών. Στην συνέχεια χωρίστηκαν σε 3 ομάδες με βάση τα επίπεδα των λιπιδίων: άτομα με φυσιολογικά επίπεδα, υπερχοληστερολαιμία και μικτή υπερλιπιδαιμία και β) 54 ασθενείς με αγγειογραφικά εκτεταμένη σταφανιαία νόσο και 41 ασθενείς με φυσιολογικά αγγεία. Η απομόνωση των HDL σωματιδίων πραγματοποιήθηκε με καταβύθιση των nonHDL λιποπρωτεϊνών με θειική δεξτρανη/MGCL₂. Η λήψη των φασμάτων πραγματοποιήθηκε σε φασματογράφο Bruker Avance DRX-500 και DRX-600 σε θερμοκρασία 298°Κ. Στο πρώτο μέρος της διατριβής μελετήθηκε το ¹H NMR φάσμα του εκχυλίσματος των λιπιδίων των HDL και nonHDL λιποπρωτεϊνών. Στο δεύτερο μέρος επιλέχθηκε ένα σύνολο ατόμων τα οποία κάλυπταν ένα ευρύ φάσμα επίπεδων λιπιδίων, υπολογίσθηκε η % σύσταση των HDL λιποπρωτεϊνών και μελετήθηκε η επίδραση των λιπιδαιμικών παραμέτρων του ορού στη σύστασή τους. Στο τρίτο μέρος, τα άτομα της προηγούμενης ενότητας χωρίστηκαν σε 3 ομάδες και συγκρίθηκε η % λιπιδιακή σύσταση των HDL και nonHDL λιποπρωτεϊνών. Επίσης, μελετήθηκαν οι διαφορές στην % λιπιδιακή σύσταση των λιποπρωτεϊνών ασθενών με καρδιαγγειακή νόσο σε σχέση με αυτούς με φυσιολογικά αγγεία. Στο τελευταίο μέρος της διατριβής διερευνήθηκε η εφαρμογή τεχνικών αναγνώρισης προτύπων στην προσέγγιση της παρουσίας της καρδιαγγειακής νόσου. Τα OSC/PLS-DA στατιστικά μοντέλα πρόβλεψαν με επιτυχία τη νόσο των αγγείων με επίπεδο εμπιστοσύνης >95%. Το φύλο των ασθενών, τα επίπεδα των τριγλυκεριδίων και της HDL-χοληστερόλης δεν επηρέασαν την πρόβλεψη της νόσου. Η ανάλυση με φασματοσκοπία ¹H NMR της λιπιδιακής σύστασης των εκχυλισμάτων των λιπιδίων των HDL και nonHDL λιποπρωτεϊνών σε παθολογικές καταστάσεις θα μπορούσε να συμβάλλει στην καλύτερη κατανόηση των παθοφυσιολογικών μηχανισμών που τις συνοδεύουν. Η συλλογή δεδομένων από ένα μεγαλύτερο αριθμό ασθενών καθώς και ο έλεγχος της επίδρασης και άλλων παραγόντων θα μπορέσει πιθανά να οδηγήσει στη δημιουργία μιας αξιόπιστης βάσης δεδομένων που θα αφορά την εγκατεστημένη καρδιαγγειακή νόσο.