Μελέτη της έκφρασης και της κλινικής σημασίας των κυκλινών και της μεθυλίωσης των ανασταλτών τους στις αιματολογικές κακοήθειες

Abstract

Aim of this study was to study the expression of type D cyclins and the methylation status of genes that are involved in cell cycle regulation pathways (CDKN2B, CDKN2A,CDKN1C, TP73, Snk/plk2, VHL) in patients with monoclonal gammopathies. Patients and methods: We studied 45 patients with multiple myeloma (MM), 4 patients with Waldenstrom's macroglobulinemia (WM), and 3 patients with monoclonal gammopathy of undetermined significance (MGUS). Quantitative RT-PCR was employed for the cyclin expression. Methylation status of each gene was analysed by methylation-specific PCR (MSP). Logistic regression analysis where gene methylation status at diagnosis was used as a single predictor variable to measure associations with the development of anemia, advanced stage disease, extramedullary disease and bone disease (all as the dependent variables). Survival curves were generated using the method of Kaplan-Meier and compared with the log-rank test. Results: Increased expression of D type cyclins was noted in MM patients. Cyclin D1 levels were significantly higher to cyclin D2 levels (p=0.01) and cyclin D3 (p=0.004). Interesting associations were noted between cyclin expression levels and relevant clinical parameters but no significant prognostic value was found. Methylation of the p15 (CDKN4B) and p16 (CDKN4A) was found in 28% and 31 % of MM patients respectively. Patients methylated for p16 were more likely to have advanced stage disease and anemia at diagnosis and had an increased risk of death, but p values did not reach significance. Methylation of p16 was not found to be a predictor of bone or extramedullary disease. Patients methylated for the p15 promoter were more likely to have anemia at diagnosis (p>0.05). No association was found between p15 methylation status and bone or extramedullary disease or overall survival. No patient was found to be methylated for CDKN1C and TP73. Methylation of the VHL promoter was found in 41 % of MM patients. Patients methylated for VHL showed an increased risk of death (HR=1.3, p=0.6), anemia (OR=2, p=0.2), extramedullary disease (OR=2.3, p=0.22) and significantly increased risk of developing development of lytic bone disease (OR =6.5, p=0.029). Snk/plk2 methylation was noted in 60% and 75% of MM and WM patients respectively. No significant association was found between snk/plk2 methylation and clinical parameters. In summary, cyclins are overexpressed in MM, but they do not hold a significant prognostic value. Genes involved in cell cycle regulation are found to be methylated in MM and WM. Several interesting trends were noted between the genes methylation status and relevant clinical parameters. These findings warrant further evaluation in a larger sample of patients in order to enhance our statistical power and better define the prognostic value of each gene's methylation status in these diseases.

Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν να μελετηθούν γονίδια που συμμετέχουν στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου, αλλά και οι επιγενετικές αλλαγές, μέσω μεθυλίωσης που αυτά μπορεί να έχουν υποστεί. Συγκεκριμένα μελετήθηκε η έκφραση και η κλινική σημασία των κυκλινών DI, D2 και D3, ενώ επιπλέον μελετήθηκε και η μεθυλίωση γονιδίων που συμμετέχουν στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου (CDKN4B, CDKN4A, CDKN1C, ΤΡ73, Snk/plk2, VHL) σε ασθενείς με μονοκλωνικές γαμμαπάθειες. Ασθενείς και Μέθοδοι. Μελετήθηκαν 45 ασθενείς με πολλαπλό μυέλωμα (ΠΜ), 4 ασθενείς με Μακροσφαιριναιμία Waldenström (MW) και 3 άνδρες ασθενείς με μονοκλωνική γαμμαπάθεια αδιευκρίνιστης σημασίας (ΜΓΑΣ). Η μελέτη της έκφρασης των κυκλινών τύπου D έγινε με τη μέθοδο RT-PCR. Η μελέτη της μεθυλίωσης των υποκινητών των γονιδίων έγινε με MSP (methylation specific PCR). Χρησιμοποιήθηκε η ανάλυση απλής λογιστικής παλινδρόμησης για να εκτιμηθεί η συσχέτιση με κλινικές παραμέτρους. Οι καμπύλες εκτίμησης επιβίωσης έγιναν με τη χρήση της μεθόδου Kaplan Meier και η σύγκρισή τους με τη μέθοδο log-rank. Αποτελέσματα. Στους ασθενείς με πολλαπλό μυέλωμα παρατηρήθηκε αυξημένη έκφραση των κυκλινών τύπου D. Οι τιμές της κυκλίνης D1 ήταν στατιστικώς σημαντικά υψηλότερες σε σχέση με τις τιμές της κυκλίνης D2 (p=0.01) και τις τιμές της D3 (p=0.004). Στατιστική ανάλυση της σχέσης των κυκλινών με κλινικές παραμέτρους ανέδειξε ενδιαφέρουσες τάσεις, χωρίς όμως να βρεθεί ιδιαίτερη προγνωστική αξία. Μεθυλίωση του CDKN2B και του CDKN2A παρατηρήθηκε σε ασθενείς με ΠΜ, σε ποσοστό 28% και 31 % αντίστοιχα. Ασθενείς με μεθυλιωμένο το CDKN2A είχαν την τάση να έχουν προχωρημένο στάδιο νόσου και αναιμία κατά τη διάγνωση και ο κίνδυνος να καταλήξουν ήταν 1,9 φορές πιο μεγάλος, διαφορά όμως στατιστικώς μη σημαντική. Ασθενείς με μεθυλιωμένο το CDKN2B είχαν την τάση να έχουν αναιμία κατά τη διάγνωση, αλλά δε βρέθηκε συσχέτιση με την παρουσία εξωμυελικής ή οστικής νόσου ή τη συνολική επιβίωση. Σε κανένα από τους ασθενείς δε βρέθηκε μεθυλίωση του CDKN1C και του ΤΡ73. Το ποσοστό των ασθενών με ΠΜ που βρέθηκε να έχει μεθυλίωση για το VHL ήταν 41%. Οι ασθενείς με μεθυλιωμένο υποκινητή του VHL είχαν μεγαλύτερο κίνδυνο να καταλήξουν (HR=1.3, p=0.6), να έχουν αναιμία (OR=2.0, p=0.2), να έχουν εξωμυελική νόσο (OR=2.3, p=0.228) και στατιστικώς σημαντικά αυξημένο κίνδυνο (κατά 6,5 φορές) εμφάνισης οστικής νόσου (p=0.018). Μεθυλίωση του snk/plk2 παρατηρήθηκε στο 60% και 75% ασθενών με ΠΜ και MW αντίστοιχα. Η κατάσταση μεθυλίωσης του snk/plk2 δεν ήταν προγνωστικός δείκτης της συνολικής επιβίωσης, ή άλλων σχετικών κλινικών παραμέτρων. Συμπεράσματα. Οι κυκλίνες παρουσιάζουν υπερέκφραση στο πολλαπλό μυέλωμα, αλλά δεν παρουσιάζουν ιδιαίτερη προγνωστική άξια. Ασθενείς με ΠΜ και MW, παρουσιάζουν μεθυλίωση γονιδίων που σχετίζονται με τη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου. Η κατάσταση μεθυλίωσης του VHL μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως προγνωστικός δείκτης ανάπτυξης οστικής νόσου σε ασθενείς με ΠΜ. Ενδιαφέρουσες τάσεις συσχέτισης της κατάστασης μεθυλίωσης και κλινικοεργαστηριακών παραμέτρων χρήζουν περαιτέρω διερεύνησης για να διευκρινιστεί και να καθοριστεί η προγνωστική τους αξία.