Δομικός και λειτουργικός χαρακτηρισμός χρωμοπρωτεϊνών

Abstract

To shed some light onto the mode of recognition of nucleosomal DNA by a chromodomain, we solved by multi-dimensional NMR spectroscopy the 3D structure of the chromodomain c2 of dMi-2 protein and explored its structure/function relationship. The domain was produced in bacteria and was shown to bind to dsDNA of various lengths in a sequence-independent manner and to histone H3. c2 folds into a compact globular domain made up of three anti-parallel ß-strands and a C-terminal α-helix packed together in the canonical a+β chromodomain fold. Analysis of the electrostatic surface potential calculated for c2 reveals a large and distinct positively charged patch on one face of the domain, despite its overall acidic pi (pI=4.90). This feature is not shared by other chromodomains of known structure and function and suggests that this patch could be the site of interaction with DNA. The aromatic cage, which is crucial in histone tail binding by typical chromodomains, such as HP1 and Polycomb, is present on the surface of c2, but significantly altered. A search of the Brookhaven Protein Databank for structural homologues revealed remarkable structural similarity of c2 with both chromo and chromoshadow domains. c2 was also found to have a clear tendency for oligomerization. Overall, the biochemical, biophysical and structural analysis of c2 showed that this chromodomain shares features of both the chromo and chromoshadow protein families and is able to interact with more than one chromatin components. The information gained from this study strongly supports the hypothesis that the chromodomain fold can be viewed as a successful structural scaffold that allows a considerable sequence variation to fulfill various functions in different molecular contexts.

Το chromodomain έχει αναδειχθεί βιβλιογραφικά σε κεντρικό "παίκτη" στην αναδιαμόρφωση της χρωματίνης, ο ρόλος του όμως έχει περιορισθεί στην αναγνώριση μετά-μεταφραστικών σημάτων με τη μορφή ομοιοπολικών τροποποιήσεων επί των ιστονικών ουρών. Με χρήση βιοχημικών τεχνικώνεπιβεβαιώθηκε η πρόσδεση του c2 απ' ευθείας σε μόρια DNA, ενώ για πρώτη φορά δείχθηκε συγγένεια και προς την ιστόνη Η3. Προκειμένου να προσδιοριστεί πώς το c2 διαφοροποιείται ώστε να εμφανίζει συγγένεια για έναν τόσο χημικά διαφορετικό από τις ιστόνες προσδέτη όπως είναι το DNA, επιχειρήθηκε η επίλυση της τριτοταγούς δομής του με NMR. Ο ολιγομερισμός του απομονωμένου c2 τιθασεύτηκε μερικώς με χρήση τεχνικών Μοριακής Βιολογίας σε βαθμό που νακαθίσταται εφικτός ο προσδιορισμός της τριτοταγούς δομής με NMR. Ανάλυση της δομής έδειξε ότι το c2 είναι μια συμπαγής, καλά αναδιπλωμένη πρωτεΐνη, αποτελούμενη από μια β- πτυχωτή επιφάνεια και μια καρβοξυτελική α-έλικα, που είναι διατεταγμένα στο χώρο, έτσι ώστε να σχηματίζουν τη χαρακτηριστική α+β αναδίπλωση των chromodomain (α+β chromodomain fold). Ο χαρακτηριστικός για τα chromodomain αρωματικός κλωβός υφίσταται μεν στην επιφάνεια του c2,διαφέρει όμως από αυτόν των "προτύπων" μελών της οικογένειας των chromodomain. Αποκαλύφθηκε επιπλέον μια ανισομερής κατανομή φορτίου στην επιφάνεια του c2, η οποία επιτρέπει την ύπαρξη θετικά φορτισμένων όψεων του μορίου, γεγονός μη αναμενόμενο δεδομένου του θεωρητικού ισοηλεκτρικού του σημείου (pI=4.90). Τα χαρακτηριστικά της επιφάνειας του θα επέτρεπαν τη συζευγμένη πρόσδεση νουκλεοσωμικού DNA και ιστονών στο c2, καθιστώντας τοτο μόνο -έως τη συγγραφή αυτής της διατριβής- chromodomain που αλληλεπιδρά με περισσότερα του ενός νουκλεοσωμικά συστατικά. Τέλος ο βιοφυσικός, βιοχημικός και δομικός χαρακτηρισμός του c2 προδίδει τον υβριδικό του χαρακτήρα μεταξύ του chromo- και του chromo-shadow domain.