Ρύθμιση της νευρωνικής μορφής της συνθετάσης του πρωτοξειδίου του αζώτου (NO) στον εγκέφαλο του επίμυ

Abstract

NO is a very important cellular messenger which, as a gas, diffuses freely across cell membranes, and exerts significant morphogenetic effects during brain development. NO is produced by the catalytic action of II synthase (NOS). In the present work we investigated the role of the two major neurotransmitter systems in the developing cortex, the glutamatergic and the GABAergic, in the control of the neuronal isoform of NOS (nNOS). We employed immunocytochemistry and Western blotting to determine the effect of the above neurotransmitter systems on nNOS levels following administration of antagonists or agonists of iontotropic glutamate or GABA receptors respectively. Our results showed that NMDA or AMPA glutamate receptors are not involved in the control of nNOS during the early postnatal developmental period. In contrast, activation of GABA-A receptors resulted in increased nNOS levels. These results reflect the depolarizing role exerted by GABA-A receptors in the developing brain, due to the increased intracellular chloride concentration, which exists during the developmental time period. We then investigated the molecular mechanism through which GABA-A receptor activation leads to increased nNOS. Our results showed that GABA-A receptor activation also leads to increased levels of the activated form of the transcription factor pCREB, in the same cells where nNOS was increased. In addition we demonstrated that the next step following GABA-A receptor activation is the opening of L-type voltage-gated calcium channels, since their blockade abolished the GABA-A receptor-induced increase in nNOS and pCREB. Based on our results we have proposed the following molecular mechanism: GABA-A receptor activation leads to depolarization of the cell membrane and consequent opening of L type voltage-gated calcium channels. Entry of calcium ions through these channels results in increased intracellular calcium concentration and activation of various kinases which can activate, through phosphorylation, transcription factor CREB. Activated CREB (pCREB) can then bind to the control region of the nNOS gene, induce its expression, leading to increased nNOS levels. We also found that pCREB leads to increased BDNF levels through the same molecular mechanism. BDNF is a well known significant morphogenetic factor, which can also regulate nNOS. The results of the present work demonstrate that GABA-A receptors, L type voltage-gated calcium channels, intracellular calcium, the transcription factor pCREB as well as BDNF play an important role in the control of nNOS expression in the cortex during the early postnatal developmental period.

Το μονοξείδιο του αζώτου (ΝΟ) είναι ένα πολύ σημαντικό μόριο μηνυματοδότης, που ως αέριο, έχει την ικανότητα να διαχέεται ελεύθερα μέσω των κυτταρικών μεμβρανών και να δρα μορφογενετικά κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του εγκεφάλου. Το ΝΟ είναι προϊόν της καταλυτικής δράσης του ενζύμου NOS. Στην παρούσα εργασία μελετήσαμε τη ρύθμιση της νευρωνικής ισομορφής της NOS από τα δύο βασικά νευροδιαβιβαστικά συστήματα στον αναπτυσσόμενο εγκεφαλικό φλοιό, το γλουταματεργικό και το GABAεργικό. Η επίδραση των παραπάνω νευροδιαβι­βαστικών συστημάτων στα επίπεδα της nNOS μελετήθηκε ανοσοϊστοχημικά και με αποτύπωση Western μετά από χορήγηση ανταγωνιστών ή αγωνιστών των ιοντο­τροπικών υποδοχέων γλουταμικού ή GABA αντίστοιχα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι υποδοχείς γλουταμικού τύπου NMDA και AMPA δεν εμπλέκονται στη ρύθμιση της nNOS κατά την χρονική περίοδο της ανάπτυξης που μελετήσαμε. Aντίθετα η διέγερση των υποδοχέων GABA τύπου Α οδήγησε σε αύξηση των επιπέδων της nNOS. Τα παραπάνω αποτελέσματα συνάδουν με το ρόλο των υποδοχέων GABA-A κατά την ανάπτυξη όπου δρουν εκπολωτικά λόγω της αυξημένης ενδοκυττάριας συγκέντρωσης ιόντων χλωρίου. Στην συνέχεια μελετήθηκε ο μοριακός μηχανισμός με τον οποίο η διέγερση των GABA-A υποδοχέων οδηγεί σε αύξηση της nNOS. Βρέθηκε ότι η διέγερση των GABA-A υποδοχέων οδηγεί στην αύξηση των επιπέδων της ενεργοποιημένης μορφής του μεταγραφικού παράγοντα pCREB, στα ίδια κύτταρα όπου παρατηρήθηκε η αύξηση της nNOS. Επιπροσθέτως τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι το επόμενο βήμα μετά την ενεργο­ποίηση των GABA-A υποδοχέων είναι η διάνοιξη των τύπου L τασεο-εξαρτώμενων διαύλων ιόντων ασβεστίου, καθόσον ο αποκλεισμός τους ανέστειλε την μέσω GABA-A προκαλούμενη αύξηση της nNOS και του pCREB. Τα αποτελέσματά μας αυτά οδηγούν στη διατύπωση του παρακάτω μοριακού μηχανισμού: Η διέγερση των GABA-A υποδοχέων οδηγεί σε εκπόλωση της κυτταρικής μεμβράνης που συνε­πάγεται διάνοιξη των τύπου L τασεο-εξαρτώμενων διαύλων ασβεστίου. Η είσοδος ιόντων ασβεστίου από τους διαύλους αυτούς έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση της ενδοκυττάριας συγκέντρωσης του ασβεστίου και την ενεργοποίηση διαφόρων κινασών που φωσφορυ­λιώνουν τον μεταγραφικό παράγοντα CREB. Ο ενεργο­ποιημένος CREB (pCREB) στη συνέχεια οδηγεί σε επαγωγή του γονιδίου της nNOS και σε αύξηση της πρωτεΐνης. Βρέθηκε, επίσης, ότι o pCREB μέσω του παραπάνω μονοπατιού οδηγεί σε αύξηση και του BDNF, ενός σημαντικού νευρικού μορφογενετικού παράγοντα, ο οποίος είναι γνωστό συμμετέχει στη ρύθμιση της nNOS. Με βάση τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής, οι υποδοχείς GABA-A, οι τασεο-εξαρτώμενοι δίαυλοι ασβεστίου τύπου L, το ενδοκυττάριο ασβέστιο, ο μεταγραφικός παράγοντας pCREB αλλά και ο BDNF, αναδεικνύονται ως σημαντικοί ρυθμιστικοί παράγοντες της έκφρασης της nNOS στον φλοιό του εγκεφάλου κατά τη φάση της ανάπτυξης αμέσως μετά τη γέννηση.