Μελέτη σε κυτταρικές καλλιέργειες της παρουσίασης του αντιγόνου από τα μονοκύτταρα του περιφερικού αίματος ασθενών που βρίσκονται σε χρόνια περιοδική αιμοκάθαρση

Abstract

The aim of the present study was to evaluate in peripheral blood mononuclear cell (PBMC) cultures, if antigen presentation from monocytes to lymphocytes in hemodialysis (HD) patients is impaired. Staphylococcal enterotoxin B (SEB) was used for triggering T-lymphocyte response. SEB was selected because it acts in an antigen presenting cell (APC) dependent way and from all PBMC it stimulates T-lymphocytes selectively. Additionally, SEB induces an interaction between APC and T-lymphocytes that imitates the interaction induced by the presentation of conventional peptide antigens from the first cells to the second. Finally, in contrary to conventional antigens, SEB stimulates a large proportion of T-lymphocytes. One of the evaluated factors was T-lymphocytes proliferation after stimulation with SEB at a concentration of 1ng/ml or 10ng/ml in PBMC cultures for 48 hours. Cell proliferation was assessed by measuring DNA synthesis using bromodeoxyuridine (BrdU) labelling and immuno-enzymatic detection. In addition, tyrosine residue phosphorylation of ζ-chain ITAMs (immunoreceptor tyrosine based activation motifs) was estimated after stimulation with SEB at a concentration of 10μg/ml for 2 minutes. Zeta-chain phosphorylation is the first event that follows an effective presentation of the antigen. Consequently, an ineffective antigen presentation would result in decreased ζ-chain phospho-rylation. The degree of ζ-chain phosphorylation was estimated by immunoprecipitation and immunoblotting with antiphosphotyrosine antibody. Strict criteria were set for entry into the study. The aim was to limit the influence of many factors that are known to affect acquired immunity in HD patients. All patients received adequate urea clearance and HD was performed with cellulose diacetate dialysers via an A-V fistula. They had the recommended values of parathormone, ferritin, and transferrin saturation. None of them was older than 65 years, had been transfused with blood recently or received vitamin D. All patients were in a good nutritional state and received erythropoietin. Finally, there were no other diseases or medications that influence the immune system. Consequently, the effect of uremia and/or HD procedure on antigen presentation was mainly examined. Thirty HD patients and twenty healthy volunteers participated into the study. Results: 1. BrdU incorporation after stimulation with SEB revealed a lower T-lymphocyte proliferation index in HD patients than in healthy volunteers. The mean BrdU uptake by lymphocytes in patient group was increased by 2.1 times following SEB stimulation at a concentration of 1ng/ml, while PBMC from the control group increased their DNA synthesis by 3.6 times following the same stimulation. Similar were the results after stimulation with SEB at a concentration of 10ng/ml. 2. T-lymphocytes from the patient group failed to increase z-chain phosphorylation after stimulation with SEB, compared to normal controls. Quantitative analysis showed a mean 2.65-fold increase of z-chain phosphorylation in control group after stimulation with SEB compared to unstimulated PBMC. In contrast, in patient group SEB stimulation induced a mean decrease in z chain phospho-rylation by a factor of 0.76. 3. Basal z-chain phosphorylation before stimulation with SEB was increased in HD patients. This finding was observed in all films, but it was not possible to be analyzed statistically due to the small number of samples that can be loaded for electrophoresis in the same gel. 4. No statistically significant correlations were confirmed among cell proliferation index or alteration in the degree of z-chain phospho-rylation after stimulation with SEB and many of the factors that are known to influence acquired immunity in HD patients. The strict criteria that were set for entry into the study seem to be responsible. Conclusions: 1. The decreased T-lymphocyte proliferation in HD patients after stimulation with an antigen presenting cell dependent stimulant, indicates that the acquired immune response in this population is deficient. A defect in antigen presentation could be speculated. 2. The above impaired T-lymphocyte response is induced by impaired z-chain phosphorylation. Zeta-chain phosphorylation is the first event that follows an effective presentation of the antigen. Consequently, the decreased ζ-chain phosphorylation in HD patients indicates that antigen presentation is impaired. 3. The increased basal z-chain phosphorylation before stimulation with SEB in HD patients suggests that T-lymphocytes are preactivated in this population. This is in accordance with other studies. T-lymphocytes preactivation could contribute to the impaired acquired immune response since it may lead these cells to premature apoptosis once they encounter pathogens.

Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να διερευνηθεί σε καλλιέργειες μονοπύρηνων κυττάρων του περιφερικού αίματος (PBMC), αν η παρου-σίαση του αντιγόνου από τα μονοκύτταρα στα λεμφοκύτταρα των ασθενών που υποβάλλονται σε χρόνια περιοδική αιμοκάθαρση είναι διαταραγμένη, συμβάλλοντας έτσι στην γνωστή από πολλά έτη ανε-πάρκεια της επίκτητης ανοσίας των ασθενών αυτών. Ως ερέθισμα για την διέγερση των Τ-λεμφοκυττάρων χρησιμοποιή-θηκε η σταφυλοκοκκική εντεροτοξίνη Β (SEB), διότι η δράση της εξαρτάται από τα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα και επιπλέον επειδή από το σύνολο των περιφερικών μονοπύρηνων του αίματος διεγείρει εκλεκτικά τα Τ-λεμφοκύτταρα. Επιπρόσθετα η αλληλεπίδραση που προ-καλεί μεταξύ του αντιγονοπαρουσιαστικού κυττάρου και του Τ-λεμφοκυττάρου μιμείται αυτήν που προκαλείται από την παρουσίαση των συμβατικών αντιγόνων από τα πρώτα κύτταρα στα δεύτερα. Τέλος, σε αντίθεση με τα συμβατικά αντιγόνα, η SEB διεγείρει μεγάλο ποσοστό των Τ-λεμφοκυττάρων. Εκτιμήθηκαν ο πολλαπλασιασμός των Τ-λεμφοκυττάρων σε καλ-λιέργεια PBMC πριν και μετά από διέγερση με SEB σε συγκεντρώσεις 1 ng/ml και 10 ng/ml για 48 ώρες. Ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός υπολογίστηκε με ανοσοενζυμική μέτρηση της ενσωμάτωσης βρωμοδε-οξυουριδίνης (BrdU) στο DNA των Τ-λεμφοκυττάρων. Επίσης εκτιμήθηκε η φωσφορυλίωση των υπολειμμάτων τυροσίνης των ITAMs (immunoreceptor tyrosine based activation motifs) της ζ-αλύσου του συμπλέγματος του υποδοχέα του αντιγόνου του Τ-λεμφοκυττάρου πριν και μετά από διέγερση με SEB σε συγκέντρωση 10μg/ml για 2 λεπτά. Η φωσφορυλίωση της ζ-αλύσου είναι το πρώτο γεγονός που ακολουθεί την επιτυχή παρουσίαση του αντιγόνου. Έτσι οποιαδήποτε διαταραχή στην παρουσίαση του αντιγόνου από τα αντιγο-νοπαρουσιαστικά κύτταρα στα Τ-λεμφοκύτταρα αποτυπώνεται άμεσα στον βαθμό μεταβολής της φωσφορυλίωσης της ζ-αλύσου. Η εκτίμηση της φωσφορυλίωσης της ζ-αλύσου έγινε με ανοσοκαθήλωση της ζ-αλύσου και κατόπιν με SDS-ηλεκτροφόρηση και ανοσοαποτύπωση με αντίσωμα έναντι της φωσφορυλιωμένης τυροσίνης. Ετέθησαν αυστηρά κριτήρια για την ένταξη των ασθενών στην μελέτη με σκοπό τον περιορισμό πολλών παραγόντων που επηρεάζουν την επίκτητη ανοσία στον πληθυσμό αυτό. Όλοι οι ασθενείς αιμοκαθαί-ρονταν επαρκώς, με μεμβράνη διοξεικής κυτταρίνης και δια αρτηριο-φλεβικής αναστόμωσης. Είχαν τις επιθυμητές τιμές παραθορμόνης, φερριτίνης και κορεσμού τρανσφερρίνης. Ελάμβαναν ερυθροποιητίνη, αλλά όχι βιταμίνη D. Δεν είχαν μεταγγιστεί πρόσφατα, βρίσκονταν σε καλή κατάσταση θρέψης και ήταν μικρότεροι από 65 ετών. Φυσικά δεν έπασχαν από άλλα νοσήματα, ούτε ελάμβαναν φάρμακα που επη-ρεάζουν το ανοσοποιητικό σύστημα. Έτσι εξετάστηκε κυρίως η επίδρασης της ουραιμίας ή/και της αιμοκάθαρσης. Στην μελέτη συμμετείχε μία κατά το δυνατό ομοιογενής ομάδα 30 αιμοκαθαιρόμενων ασθενών. Επίσης συμμετείχαν 20 υγιείς μάρτυρες. Αποτελέσματα: 1. Στην ομάδα των ασθενών η μέση πρόσληψη BrdU βρέθηκε 2,1 φορές υψηλότερη μετά από διέγερση με SEB σε συγκέντρωση 1ng/ml. Στην ομάδα των μαρτύρων η διέγερση με SEB αύξησε ακό-μα περισσότερο την πρόσληψη BrdU, κατά 3,6 φορές. Παρόμοια ήταν και τα αποτελέσματα μετά από διέγερση με SEB σε συγκέ-ντρωση 10ng/ml. 2. Στην ομάδα των υγιών μαρτύρων η μέση αύξηση της φωσφο-ρυλίωσης της ζ-αλύσου βρέθηκε 2,65 φορές υψηλότερη μετά από διέγερση με SEB. Αντίθετα τα Τ-λεμφοκύτταρα των αμοκαθαιρό-μενων ασθενών απέτυχαν να αυξήσουν την φωσφορυλίωση της ζ-αλύσου. Μετά από διέγερση με SEB η φωσφορυλίωση της ζ-αλύσου ελαττώθηκε κατά 24% σε σχέση με τη φωσφορυλίωση χωρίς διέγερση με SEB. 3. Παρατηρήθηκε σημαντικού βαθμού φωσφορυλίωση της ζ-αλύσου στα λεμφοκύτταρα των αιμοκαθαιρόμενων ασθενών που δεν είχαν διεγερθεί με SEB. Το εύρημα αυτό αποτυπώθηκε σε κάθε film, αλλά η στατιστική επεξεργασία του δεν ήταν δυνατή λόγω του περιορισμένου αριθμού των δειγμάτων που μπορούν να ηλεκτροφο-ρηθούν ταυτόχρονα στην ίδια γέλη. 4. Δεν βρέθηκαν στατιστικά σημαντικές συσχετίσεις μεταξύ του δείκτη κυτταρικού πολλαπλασιασμού ή της μεταβολής της φωσφορυ-λίωσης της ζ-αλύσου μετά από διέγερση με SEB και πολλών από τους παράγοντες που είναι γνωστό ότι επηρεάζουν την επίκτητη ανοσία στους αιμοκαθαιρόμενους ασθενείς. Αυτό πιθανότατα οφείλεται στα αυστηρά κριτήρια που εφαρμόστηκαν για την ένταξη των ασθενών στη μελέτη. Συμπεράσματα: 1. Ο ελαττωμένος πολλαπλασιασμός των Τ-λεμφοκυττάρων στους αιμοκαθαιρόμενους ασθενείς μετά από διέγερση με ένα απόλυτα εξαρτώμενο από τα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα ερέθισμα, καταδεικνύει αφενός ότι η επίκτητη ανοσία είναι ανεπαρκής στον πληθυσμό αυτό και αφετέρου ότι μια διαταραχή στην παρουσίαση του αντιγόνου είναι πιθανόν υπεύθυνη. 2. Αυτή η ελαττωμένη απάντηση των Τ-λεμφοκυττάρων στους αιμοκα-θαιρόμενους ασθενείς φαίνεται ότι οφείλεται στην ελαττωμένη φωσφορυλίωση της ζ-αλύσου. Η φωσφορυλίωση της ζ-αλύσου είναι το πρώτο γεγονός που ακολουθεί την επιτυχή παρουσίαση του αντιγόνου. Έτσι η ελαττωμένη φωσφορυλίωση της ζ-αλύσου κατά-δεικνύει ότι η παρουσίαση του αντιγόνου από τα αντιγονοπα-ρουσιαστικά κύτταρα στα Τ-λεμφοκύτταρα είναι ανεπαρκής στον πληθυσμό αυτό. 3. Η σημαντικού βαθμού φωσφορυλίωση της ζ-αλύσου στα λεμφο-κύτταρα των αιμοκαθαιρόμενων ασθενών που δεν είχαν διεγερθεί με SEB καταδεικνύει ότι τα Τ-λεμφοκύτταρα των ασθενών αυτών είναι προενεργοποιημένα. Γεγονός που διαπιστώθηκε και σε άλλες μελέτες. Η προενεργοποίηση αυτή πιθανό να οδηγεί τα κύτταρα αυτά σε πρόωρη απόπτωση την στιγμή ακριβώς που πρέπει να δρά-σουν, δηλαδή κατά την επαφή με τους λοιμογόνους παράγοντες.