Η αντιστροφή ρόλων του μιτοχονδριακού DNA στη διπλή μονογονεϊκή κληρονομικότητα: διερεύνηση της κατανομής των μητρικής και πατρικής προέλευσης μιτοχονδριακών γονιδιωμάτων στους σωματικούς ιστούς και στους γαμέτες του Mytilus galloprovincialis

Abstract

Doubly Uniparental Inheritance (DUI) is the only known exception to the rule of maternal inheritance of mitochondrial DNA (mtDNA) in the metazoans. In Mytilus and in some other bivalves in other bivalves, two types of mtDNA have been detected. The first is called F (Female) and is passed by the mother to both sexes of the progeny. The second is called M (Male) and follows a different route: It passes through the germ line only from father to son. The result is that female offspring are homoplasmic (containing only the F type) and male offspring are heteroplasmic (containing the F type in their somatic tissues, but the M type in the gonad). Nevertheless, there are reports of the presence, although in small amounts, of the M type in male and female somatic tissues that seem to override that rule. Furthermore, it is believed that occasionally an F molecule can enter the germ line, replace the M and assume its role. This phenomenon, which is called “role reversal” or “masculinization” of the F molecule, plays a very important role in the understanding of DUI, as it explains the divergence of the two mitochondrial genomes in different species with DUI, without the need to accept that the phenomenon emerged many times independently. The above atypical presence of the genomes and especially the hypothesis of “masculinization” are studied here. The objective is to obtain a clearer picture of the distribution of the two genomes in species with DUI. The study has concentrated on the gametes, since the genomes are passed to the next generation through these cells. As a result, the stability of DUI is based on the mechanisms that ensure that the oocyte contains only the maternal genome and that the spermatozoon contains only the paternal genome. One of the most difficult problems that arise in the study of the distribution of the M type is the high possibility that the examined somatic cells are contaminated by the gonad, since in Mytilus the gonad does not form a distinct organ, but is spread in the mantle tissue. In order to avoid this, new techniques that include a rapid boiling step were developed. Purified samples under this procedure revealed a much more limited presence of the M type in the somatic tissues of adult males, than the one in the published reports. In situ hybridisation experiments confirmed that the limited presence which was detected was not an artifact caused by contamination, but is related to leakage of M in the somatic tissues. Shortly, this set of experiments revealed that: 1. The atypical presence of the M type in earlier reports has been overestimated, because these studies had not been taken any contaminationavoiding measures. 2. The mechanism that aggregates the paternal mitochondria to the cells that are going to form the male gonad is not very strict and thus occasionally allows the leakage of the M type into the somatic tissues. 3. It is absolutely necessary that we obtain purified samples when we are examining the distribution of M and F mtDNA in various tissues, otherwise the results will be altered by contamination. According to the last conclusion the detection of role reversal events was based in the study of the mtDNA that is contained in the male gametes, but with the application of techniques that ensured the collection of pure samples of spermatozoa, free of contamination from somatic cells or cell fragments. In particular, the spermatozoa were forced to swim through a solution of Percoll. Only the M type was recovered in total DNA extractions from Percoll-treated sperm, in all but one sample. In that exceptional male the sperm contained an F-type molecule, which was different from the genome in the male’s somatic tissues. Thus, in all cases only the paternal mitochondrial genome was detected. The fact that in that exceptional male the paternal genome looked more like the typical F than the M reveals an older role-reversal event. This mitochondrial genome can be a very useful tool to examine if the F molecules which change their route of inheritance and assume the role of the M carry certain elements in order to respond to their new role, or if they undergo certain changes, as a result of their presence in a different environment (in the male germ line instead of the oocyte). This was the main reason that made the determination of the complete sequence of that genome compulsory. ..........................

Το φαινόμενο της Διπλής Μονογονεϊκής Κληρονομικότητας (ΔΜΚ) απο- τελεί τη μοναδική γνωστή εξαίρεση στον κανόνα της μητρικής κληρονομικότη- τας του μιτοχονδριακού DNA στα μετάζωα. Στο γένος Mytilus καθώς και σε άλλα δίθυρα, έχει διαπιστωθεί η ύπαρξη δύο τύπων μιτοχονδριακού DNA (mtDNA), ο τύπος F, ο οποίος κληρονομείται από τη μητέρα και στα δύο φύλα των απογόνων και ο τύπος Μ, ο οποίος κληρονομείται αποκλειστικά μέσω της σπερματικής γραμμής από τον πατέρα στους αρσενικούς απογόνους. Έτσι, οι θηλυκοί απόγονοι περιέχουν mtDNA μητρικής προέλευσης, ενώ οι αρσενικοί περιέχουν μεν μητρικό mtDNA (F) στους σωματικούς ιστούς τους, αλλά στη γονάδα τους εντοπίζεται το πατρικής προέλευσης Μ mtDNA. Κατά τη μελέτη της ΔΜΚ έχουν περιστασιακά αναφερθεί περιπτώσεις παρουσίας του πατρικού γονιδιώματος σε σωματικούς ιστούς αρσενικών και θηλυκών ατόμων. Επίσης, στα είδη με ΔΜΚ θεωρείται ότι περιστασιακά συμβαίνουν φαινόμενα αντιστρο- φής ρόλων του mtDNA, όπου ένα μόριο τύπου F διεισδύει στη σπερματική γραμμή, εκτοπίζοντας τον τύπο Μ, και αναλαμβάνει πλέον το ρόλο που εκείνος είχε. Το φαινόμενο αυτό αναφέρεται ως “αρρενοποίηση” και η διερεύνησή του θεωρείται ιδιαίτερα σημαντική, καθώς εξηγεί το βαθμό απόκλισης των δύο γονιδιωμάτων στα είδη με ΔΜΚ, χωρίς την ανάγκη της υπόθεσης ότι η ΔΜΚ έχει ανακαλυφθεί ανεξάρτητα πολλές φορές. Σκοπός της παρούσας διατριβής είναι η διερεύνηση της μη αναμενόμε- νης παρουσίας των δύο τύπων mtDNA σε γαμετικά και σωματικά κύτταρα αρσενικών και θηλυκών ατόμων του είδους Mytilus galloprovincialis και ιδιαί- τερα η μελέτη του φαινομένου της “αρρενοποίησης” του τύπου F. Στόχος είναι η συμβολή στη διαμόρφωση μίας καθαρότερης εικόνας για την κατανομή των δύο τύπων mtDNA στα είδη με ΔΜΚ. Η μελέτη επικεντρώνεται στα γενετικά κύτταρα, καθώς αυτά είναι τα κύτταρα που θα μεταδώσουν το mtDNA στις επόμενες γενιές, οπότε η διατήρηση του φαινομένου της ΔΜΚ θα εξαρτηθεί από το πόσο καλά λειτουργούν οι μηχανισμοί της κατά τη δημιουργία τους και κατά την ανάπτυξη του ζυγωτού αμέσως μετά τη γονιμοποίηση. Κατά τη μελέτη της κατ’ εξαίρεση παρουσίας του τύπου Μ στους σωμα- τικούς ιστούς το κυριότερο πρόβλημα ήταν η πιθανότητα μόλυνσης των υπό εξέταση ιστών από κύτταρα της γονάδας, λόγω του ότι η γονάδα στα Mytilus δεν αποτελεί ένα καλά σχηματισμένο όργανο, αλλά διαχέεται στα κύτταρα του μανδύα. Για λόγο αυτό αναπτύχθηκαν τεχνικές αποφυγής μολύνσεων κατά την ανατομία (κατεργασία βρασμού). Η ανάλυση δειγμάτων με PCR μετά την κατεργασία αυτή έδειξε πολύ πιο περιορισμένη παρουσία του τύπου Μ στους σωματικούς ιστούς των αρσενικών ατόμων, από ότι αναφέρονταν στη μέχρι τότε βιβλιογραφία. Περαιτέρω πειράματα υβριδοποιήσεων in situ κλήθηκαν να απαντήσουν οριστικά αν οι περιπτώσεις κατά τις οποίες παρατηρήθηκε παρου- σία του τύπου Μ παρά την κατεργασία βρασμού οφείλονταν σε μόλυνση ή όχι. Οι υβριδοποιήσεις in situ επαλήθευσαν την εικόνα των πειραμάτων PCR, καθώς έδειξαν την παρουσία τύπου Μ σε σωματικούς ιστούς. Ο κύκλος αυτός πειραμάτων συνοπτικά έδειξε ότι: 1. Η παρουσία του τύπου Μ στη βιβλιογραφία είναι υπερτιμημένη, καθώς δεν είχαν ληφθεί μέτρα αποφυγής μολύνσεων από κύτταρα της γονά- δας. 2. Κατά την ανάπτυξη του εμβρύου ο μηχανισμός που εγκαθιδρύει το mtDNA της σπερματικής γραμμής στην αρσενική γονάδα επιτρέπει διαρ- ροές προς τα σωματικά κύτταρα, με αποτέλεσμα την παρουσία του τύπου Μ στους σωματικούς ιστούς. 3. Από τεχνικής άποψης, παγιώνεται η αντίληψη ότι για τη μελέτη της παρουσίας ή μη των Μ και F mtDNA σε διάφορους ιστούς, είναι ανα- γκαία η εφαρμογή μεθόδων ώστε να εξασφαλίζεται η μελέτη σε δείγ- ματα απαλλαγμένα από μολύνσεις και να οδηγούμαστε με βεβαιότητα σε συμπεράσματα. Για το λόγο αυτό η προσπάθεια εντοπισμού φαινομένων αντιστροφής ρόλων βασίστηκε σε μελέτη γαμετών με την εφαρμογή τεχνικών που εξασφα- λίζουν την παραλαβή καθαρών δειγμάτων σπερματοζωαρίων, απαλλαγμένων από προσμίξεις σωματικών κυττάρων. Συγκεκριμένα πραγματοποιήθηκαν πει- ράματα PCR με στόχο την ανίχνευση μητρικού mtDNA σε δείγματα σπερματο- ζωαρίων, τα οποία είχαν προηγουμένως καθαριστεί με περκόλη. ......................