Ανάλυση του βιολογικού ρόλου της ογκοκατασταλτικής πρωτεΐνης CYLD σε λεμφοκυτταρικούς πληθυσμούς

Abstract

The cylindromatosis tumor suppressor gene (Cyld) encodes a deubiquitinating enzyme (CYLD) with immunoregulatory function. In this study we evaluated the role of Cyld in T-cell ontogeny by generating a mouse (CyldD9) with a thymocyte-restricted Cyld mutation that causes a carboxyl-terminal truncation of the protein and reciprocates catalytically inactive human mutations. Mutant mice had dramatically reduced single positive thymocytes and a substantial loss of peripheral T-cells. The analyses of polyclonal and TCR-restricted thymocyte populations possessing the mutation revealed a significant block in positive selection and the increased occurrence of apoptosis at the double-positive stage. Interestingly, in the context of MHC class I and II restricted TCR transgenes, lack of functional CYLD caused massive deletion of thymocytes that would have been positively selected, consistent with an impairment of positive selection. Biochemical analysis revealed that Cyld?9 thymocytes exhibit abnormally elevated basal activity of NF-kB and JNK. Most importantly, inactivation of NEMO restored fully the NF-kB activity of CyldD9 thymocytes to physiological levels and rescued their developmental and survival defect. Collectively, our study identified a fundamental role for functional CYLD in establishing the proper threshold of activation for thymocyte selection by a NEMO-dependent mechanism. In order to evaluate Cyld’s function in macrophages a a mouse (CyldD9) was generated with a thymocyte-restricted Cyld mutation that causes a carboxyl-terminal truncation of the protein and reciprocates catalytically inactive human mutations. Mutant mice were viable and they did not exhibit any defects in hematopoiesis. However, mutant mice were less susceptible to LPS induced endotoxin stress. Moreover, Cyld Δ9 macrophages could not be recruited to the inflammatory site in an vivo model of aseptic peritonitis. Interestingly, Cyld Δ9 MEFs showed defects in microtubules reorganization and migration when they were pretreated with nocodazole. Collectively, our data establish CYLD as a key molecule that regulates migration of different cell types due to its interaction with tubulin.

Στα πλαίσια της παρούσας διδακτορικής διατριβής επιδιώχθηκε να διασαφηνισθεί η βιολογική λειτουργία της πρωτεΐνης CYLD σε πληθυσμούς λευκοκυττάρων και ιδιαίτερα σε πληθυσμούς Τ λεμφοκυττάρων και μακροφάγων. Το γονίδιο Cyld κωδικοποιεί για ένα ένζυμο αποουβικιτίνωσης, τη CYLD, η οποία επιτελεί ανοσορυθμιστική λειτουργία. Στην παρούσα ερευνητική εργασία αξιολογήθηκε ο ρόλος του γονιδίου Cyld στην ανάπτυξη των Τ λεμφοκυττάρων. Για να επιτευχθεί αυτό δημιουργήθηκε ένας ποντικός (Cyld Δ9) ο οποίος έφερε μια μετάλλαξη στο γονίδιο Cyld που περιοριζόταν αποκλειστικά στα θυμοκύτταρα. Η μετάλλαξη αυτή προκαλεί θραύση στο καρβοξυτελικό τμήμα της πρωτεΐνης και προσομοιάζει τις καταλυτικά ανενεργές μεταλλάξεις οι οποίες παρατηρούνται στον άνθρωπο. Οι μεταλλαγμένοι ποντικοί εμφάνιζαν δραματική μείωση των απλά θετικών SP θυμοκυττάρων και απώλεια των περιφερικών Τ κυττάρων. Η ανάλυση πολυκλωνικών καθώς και περιοριζόμενων από διαγονιδιακούς TCR υποδοχείς θυμοκυττάρων που έφεραν τη μετάλλαξη αποκάλυψε σημαντικό πρόβλημα στη διαδικασία της θετικής επιλογής καθώς και αυξημένη απόπτωση στο στάδιο των διπλά θετικών DP θυμοκυττάρων. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός πώς στο πλαίσιο διαγονιδιακών TCR που αναγνωρίζουν το αντιγόνο που παρουσιάζεται από μόρια τάξης Ι και ΙΙ, η έλλεψη λειτουργικής CYLD προκάλεσε μαζική απαλοιφή των θυμοκυττάρων υπό συνθήκες που θα έπρεπε να έχουν επιλεγεί θετικά. Το γεγονός αυτό υποδηλώνει πρόβλημα στη διαδικασία της θετικής επιλογής. Βιοχημική ανάλυση αποκάλυψε ότι τα Cyld Δ9 θυμοκύτταρα εμφάνιζαν μη φυσιολογική, ιδιαίτερα υψηλή ενεργοποίηση τόσο του μεταγραφικού παράγοντα NF-κΒ αλλά και των JNK μορίων. Αξιοσημείωτα, η ανενεργοποίηση του NEMO αποκατέστησε πλήρως τα επίπεδα ενεργοποίησης του NF-κΒ διασώζοντας τα προβλήματα ανάπτυξης και επιβίωσης που παρατηρήθηκαν. Συνολικά, τα αποτελέσματα αυτά ταυτοποίησαν το θεμελιώδη ρόλο της λειτουργικής CYLD στην εγκαθίδρυση του κατάλληλου ορίου ενεργοποίησης για την επιλογή των θυμοκυττάρων κατά τρόπο που εξαρτάται από το NEMO. Προκειμένου να διαλευκανθεί η βιολογική λειτουργία της CYLD σε πληθυσμούς μακροφάγων δημιουργήθηκε ένας ποντικός (Cyld Δ9) ο οποίος έφερε την μετάλλαξη στο γονίδιο Cyld που προαναφέρθηκε και που περιοριζόταν αποκλειστικά στα κύτταρα της μυελοειδούς σειράς. Οι ποντικοί αυτοί δεν εμφάνιζαν αιμοποιητικά προβλήματα, αλλά ήταν περισσότερο ανθεκτικοί στο επαγόμενο από LPS ενδοτοξικό σοκ. Επιπρόσθετα, όταν απουσίαζε η λειτουργική CYLD τα μακροφάγα δε μπορούσαν να στρατολογηθούν στο σημείο της φλεγμονής σε ένα in vivo μοντέλο ασηπτικής περιτονίτιδας. Τέλος, παρατηρήθηκε μειωμένη ικανότητα αναδιοργάνωσης των μικροσωληνίσκων και μεταναστευτικής ικανότητας σε Cyld Δ9 εμβρυικούς ινοβλάστες όταν είχαν υποστεί κατεργασία με το χημικό παράγοντα nocodazole. Συνολικά, τα αποτελέσματα αυτά αναδεικνύουν τη CYLD σε σημαντικό μόριο που ελέγχει την κυτταρική μετανάστευση διαφορετικών κυττάρων, γεγονός που σχετίζεται με την ικανότητα της να αλληλεπιδρά με μικροσωληνίσκους.