Μελέτη της μεταγωγής σήματος από τους υποδοχείς του TNF και χαρακτηρισμός της πρωτεΐνης USP31

Abstract

The tumor necrosis factor superfamily of cytokines and receptors (TNF/TNFR) activate signalling pathways for cell proliferation, differentiation and apoptosis. CD40 Receptor is a member of the Tumor Necrosis Factor Receptors (TNFR) and is expressed mainly on the surface of B lymphocytes. CD40 interacts with CD40 Ligand (CD154) which is expressed mainly on T lymphocytes. LMP1 is a pseudoreceptor of the TNFR superfamily which mimics CD40 signalling and is constitutively activated. TRAFs constitute a family of proteins that participate in signal transduction by members of the TNF receptor superfamily. The amino terminal region of TRAFs is rich in cysteine and histidine residues, arranged in putative zinc-finger motifs and a more complex RING finger motif. TRAF2 and TRAF6 have a ubiquitin ligase activity which is dependent on the integrity of their RING finger domain and has been associated with the ability to activate the NF-κB and AP1 signalling pathways. Protein modification by ubiquitination has been primarily associated with degradation by the proteasome. However, protein ubiquitination has also been implicated in other cellular functions, including cell cycle regulation, signal transduction, transcription regulation, receptor endocytosis, ribosomal function etc. In previous studies of our research team, a yeast two-hybrid screening was performed in order to elucidate further the TRAF2 signalling mechanism. One of the isolated proteins demonstrated a strong positive interaction with wild type TRAF2, but very weak or no interaction with a mutant TRAF2 at the RING finger domain. This protein was studied further and turned out to be identical to a ubiquitin specific protease named USP31. Comparison of the USP31 cDNA sequence with human ESTs revealed that at least two USP31 cDNAs exist. One cDNA encodes for a 1035-amino-acid long polypeptide (USP31, long isoform) whereas the other encodes for a 485-amino-acid long polypeptide (short isoform, USP31S1). The two isoforms of USP31 share a common amino terminal region of 483 amino acids and contain all eight characteristic motifs of known deubiquitinases. Northern blot analysis of normal tissues and cancer cell lines revealed two major mRNA species of approximately 4.4 and 2.4 kb. The 4.4 kb mRNA was expressed in all normal tissues and cancer cell lines tested, while the 2.4 kb mRNA was expressed only in cancer cell lines. These mRNAs are likely to be derived from alternative splicing and may code for USP31 and USP31S1 respectively. USP31 was examined for its ability to act as a ubiquitin specific protease (USP/UBP). In addition to wild type USP31, a point mutant containing a serine instead of cysteine at position 98 (USP31C98S) was constructed and tested for its enzymatic activity. Cysteine-98 corresponds to a highly conserved cysteine of the catalytic domain of deubiquitinating enzymes (Cys box). USP31, USP31C98S and USP31S1 were tested for their ability to cleave tetraubiquitin in vitro. Wild type full length USP31 readily cleaved the tetrameric substrate to its monomer, dimer and trimer. However, the point mutant USP31C98S and the short isoform USP31S1 were enzymatically inactive. Furthermore, USP31 was tested for its deubiquitinating specificity towards lysine-48 or lysine-63-linked polyubiquitin chains. Lysine-48-linked polyubiquitin chains usually mark proteins for proteasomal degradation whereas lysine-63-linked polyubiquitin chains have been associated primarily with non-proteolytic regulatory processes. Wild type USP31 cleaved almost completely lysine-63-linked polyubiquitin. Moreover, it cleaved partially lysine-48-linked polyubiquitin. The point mutant USP31C98S or the short isoform USP31S1 did not cleave any of the two substrates. These results demonstrate that USP31 is a deubiquitinating enzyme that cleaves preferentially lysine-63-linked polyubiquitin chains. USP31 can also cleave lysine-48-linked polyubiquitin chains albeit to a lesser extent. The ability of USP31 to interact with TRAF2 in mammalian cells was tested by co-immunoprecipitation experiments in HEK 293T cells. These experiments confirmed the specific interaction of USP31 and TRAF2 which requires an intact RING finger domain of TRAF2. Indirect immunofluorescense showed that USP31 is localized predominantly in the nucleus and to some extent in the cytoplasm. .................................................................................................

Tα μέλη της υπεροικογένειας των κυτοκινών και των υποδοχέων του παράγοντα νέκρωσης όγκων (TNF/TNFR) ενεργοποιούν μονοπάτια μεταγωγής σήματος για τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, τη διαφοροποίηση και την απόπτωση. Ο υποδοχέας CD40 είναι μέλος της οικογένειας των υποδοχέων TNFR και εκφράζεται κυρίως σε Β-λεμφοκύτταρα. Αλληλεπιδρά με τον συνδέτη CD40L (CD154), ο οποίος εκφράζεται κυρίως σε Τ-λεμφοκύτταρα. Η πρωτεΐνη LMP1 είναι ένας «ψευδοϋποδοχέας» της υπεροικογένειας TNFR, που μιμείται τη μεταγωγή σήματος από τον υποδοχέα CD40 και είναι συνεχώς ενεργoποιημένος. Oι πρωτεΐνες ΤRAF συμμετέχουν στη μεταγωγή σήματος από τους υποδοχείς της υπεροικογένειας TNFR. Η αμινοτελική περιοχή των πρωτεϊνών TRAF είναι πλούσια σε κυστεΐνη και ιστιδίνη, οι οποίες συγκροτούν δομές δακτυλίων ψευδαργύρου καθώς και μια πιο σύνθετη δομή που ονομάζεται RING Finger. Οι πρωτεΐνες TRAF2 και TRAF6 έχουν ενζυμική δράση λιγάσης της ουβικιτίνης, η οποία εξαρτάται από την ακεραιότητα της δομής RING Finger και σχετίζεται με την ικανότητά τους να ενεργοποιούν τους μεταγραφικούς παράγοντες NF-κΒ και AP1. H ουβικιτίνωση των πρωτεϊνών είναι μια μετά-μεταφραστική τροποποίηση, η οποία έχει συσχετιστεί πρωταρχικά με την αποικοδόμηση από το πρωτεάσωμα. Ωστόσο, η ουβικιτίνωση εμπλέκεται και σε άλλες κυτταρικές λειτουργίες, όπως η ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου, η μεταγωγή σήματος, η ρύθμιση της μεταγραφής, η ενδοκυττάρωση υποδοχέων, η λειτουργία των ριβοσωμάτων κ.α. Σε προηγούμενες μελέτες της ερευνητικής μας ομάδας, έγινε χρήση της τεχνικής των δύο υβριδίων στο σακχαρομύκητα, προκειμένου να διερευνηθεί περαιτέρω ο μηχανισμός μεταγωγής σήματος από την πρωτεΐνη TRAF2. Με τη βοήθεια της τεχνικής των δύο υβριδίων απομονώθηκε μια πρωτεΐνη, η οποία παρουσιάζει ισχυρή θετική αλληλεπίδραση με την «άγριου τύπου» πρωτεΐνη TRAF2. Αντίθετα, δεν αλληλεπιδρά με μια μεταλλαγμένη μορφή της πρωτεΐνης TRAF2, ως προς στην περιοχή RING Finger. Η συγκεκριμένη πρωτεΐνη μελετήθηκε περαιτέρω και αποδείχτηκε ότι ταυτίζεται με μια ειδική πρωτεάση της ουβικιτίνης που ονομάζεται USP31 (Ubiquitin Specific Protease 31). Η σύγκριση του cDNA της πρωτεΐνης USP31 με αλληλουχίες cDNA του ανθρώπου από βάσεις δεδομένων (ESTs) αποκάλυψε την ύπαρξη τουλάχιστον δύο cDNA για την πρωτεΐνη USP31. Το ένα cDNA κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη 1035 αμινοξέων (USP31, μεγάλη ισομορφή), ενώ το δεύτερο κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη 485 αμινοξέων (USP31S1, μικρή ισομορφή). Οι δύο ισομορφές έχουν κοινή αμινοτελική περιοχή 483 αμινοξέων και περιέχουν και τα οκτώ χαρακτηριστικά μοτίβα των γνωστών ενζύμων αποουβικιτίνωσης. Ο υβριδισμός τύπου Northern που έγινε τόσο σε φυσιολογικούς ιστούς, όσο και σε καρκινικές κυτταρικές σειρές, αποκάλυψε την ύπαρξη δύο mRNA μεγέθους 4,4 και 2,4 χιλιάδων βάσεων. To mRNA μεγέθους 4,4 χιλιάδων βάσεων ανιχνεύθηκε σε όλους τους ιστούς και τις καρκινικές κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν. To mRNA μεγέθους 2,4 χιλιάδων βάσεων ανιχνεύθηκε μόνο σε καρκινικά κύτταρα. Τα συγκεκριμένα mRNA μπορεί να προκύπτουν με εναλλακτική διασύνδεση (alternative splicing) και μπορεί να κωδικοποιούν αντίστοιχα τη μεγάλη (USP31) και τη μικρή ισομορφή (USP31S1). Η πρωτεΐνη USP31 εξετάστηκε ως προς την ικανότητά της να δρα ως ειδική πρωτεάση της ουβικιτίνης (USP/UBP). Για το σκοπό αυτό, κατασκευάστηκε επιπλέον μια μεταλλαγμένη πρωτεΐνη (USP31C98S), στην οποία η κυστεΐνη στη θέση 98 έχει αντικατασταθεί από το αμινοξύ σερίνη. Η κυστεΐνη-98 αντιστοιχεί σε μια ιδιαίτερα διατηρημένη κυστεΐνη της καταλυτικής περιοχής («κουτί» κυστεΐνης). Η πρωτεΐνη USP31, η μετάλλαξη USP31C98S και η μικρή ισομορφή USP31S1 εξετάστηκαν ως προς την ικανότητά τους να υδρολύουν το υπόστρωμα της τετραουβικιτίνης in vitro. Η πρωτεΐνη USP31 υδρολύει το τετραμερές υπόστρωμα στα μονομερή, διμερή και τριμερή ουβικιτίνης αντίστοιχα. Αντίθετα, οι πρωτεΐνες USP31C98S και USP31S1 είναι ενζυμικά ανενεργές. Επιπρόσθετα, διερευνήθηκε η εξειδίκευση της ενζυμικής δράσης της πρωτεΐνης USP31, απέναντι σε αλυσίδες πολυουβικιτίνης που συνδέονται μέσω της λυσίνης-48, ή της λυσίνης-63, κάθε μορίου ουβικιτίνης. .......................................................................................................................................