Μελέτη της επίδρασης του αναστολέα του υποδοχέα της αγγειοτασίνης ΙΙ και του αναστολέα της φωσφοδιεστεράσης στην σχετιζόμενη με την οξειδωτική καταπόνηση δυσλειτουργία του ενδοθηλίου μέσω παρακολούθησης δεικτών ενδεικτικών της λειτουργίας του σε επίμυες με επαγόμενο από στρεπτοζοτοκίνη ινσουλινοεξαρτώμενο διαβήτη

Abstract

Type 1 diabetes, an autoimmune disease in which T lymphocytes attack the insulin-producing β cells, leading to loss of insulin production, characterized also by a low grade systematic inflammation responsible for the evolution of micro- and macro vasculopathy diabetic complications. Angiotensin II has been recognized to be not only a potent vasoconstrictor but to possess also apoptotic, proinflammatory and profibrotic effects and to induce ROS production and endothelial dysfunction. Intracellular cAMP levels are also recognised to control the development of inflammation, regulating inflammatory cytokine production and ROS/RNS generation by lymphocytes and inflammatory cells. Therefore, the aim of the present thesis was to study the role of local and systemic RAS system as well as the role of intracellular cAMP and PDE4 on the function of Langerhans islets and vascular endothelium. Materials and methods In this study male Wistar rats (205 – 250g) were used. Diabetes was induced by an intraperitoneal injection of Streptozotocin (STZ; 65mg/kg). The animals considered as diabetic if their blood glucose levels were more than 200 mg/dl. Two series of experiments were performed, each of which lasted for eight days. In the first series of experiments rats were randomized into three groups: control rats, untreated diabetic rats and diabetic rats treated with Losartan (20 mg kg-1 day-1). In the second series of experiments rats where randomized into five groups: control rats, untreated diabetic rats and three groups of diabetic rats treated with 3,5, 7, and 10.5 mg kg-1day-1 Rolipram, respectively. Rolipram was an offer of Shering Company (Berlin Germany). Blood glucose and body weight 2 2 were determined as markers of metabolic state at 0, 3, 7 and 11 days after the administration of STZ. At the end of both experiments the rats were sacrificed by decapitation. Blood and pancreas were taken for analysis. Grading of islet destruction was performed using paraffin sections of pancreas stained with hematoxylin and eosin. The number of insulin producing beta-cells estimated immunohistochemically by the percentage islet area as well as the percentage of the total area of pancreatic slices that were positive to anti-insulin antibodies. Protein nitration was also immunohistochemically estimated by using antityrosine antibodies to estimate the degree of nitrosative stress in pancreas sections.STZ produced diabetes in rats 72 hours after its administration (blood glucose levels > 200mg/dl). Blood glucose levels enhanced and body weight reduced in a time–dependent manner during the eleven days of evolution of untreated diabetes which was in accordance with the degree of islets destruction (63% of islets were of 3+ grade) found at the end of experiment. The number of b-cells, evaluated by the % islet area and % area of pancreas section positive to antiinsulin antibodies was also significantly decreased.

Ο σακχαρώδης τύπου 1 διαβήτης, αυτοάνοση νόσος όπου τα Τ λεμφοκύτταρα επιτίθενται στα ινσουλινοπαραγωγά β- κύτταρα των νησιδίων οδηγώντας στην απώλεια της ικανότητας παραγωγής ινσουλίνης, χαρακτηρίζεται από μια χαμηλού βαθμού συστηματική φλεγμονή που είναι υπεύθυνη για την εξέλιξη των μικρο- και μάκρο- αγγειακών βλαβών που αποτελούν συχνές επιπλοκές του διαβήτη. Η αγγειοτενσίνη ΙΙ έχει αναγνωριστεί όχι μόνο ως ισχυρός αγγειοσυσταλτικός παράγοντας αλλά και ως ένας παράγοντας που παρουσιάζει απόπτωτικές, προ- φλεγμονώδεις και προθρομβωτικές ιδιότητες και επάγει την παραγωγή αντιδραστικών ριζών οξυγόνου (ROS) όπως επίσης και δυσλειτουργία του ενδοθηλίου. Τα ενδοκυτταρικά επίπεδα του cAMP έχει αναγνωρισθεί ότι ελέγχουν την ανάπτυξη φλεγμονής, ρυθμίζοντας την παραγωγή φλεγμονωδών κυτταροκινών και την παραγωγή ROS/RNS από τα λεμφοκύτταρα και τα φλεγμονώδη κύτταρα. Δια τούτο, ο στόχος της παρούσας διατριβής ήταν να μελετηθεί ο ρόλος του τοπικού και συστηματικού συστήματος RAS καθώς επίσης και ο ρόλος του ενδοκυτταρικού cAMP και της PDE4 στην ανάπτυξη φλεγμονής επηρεάζοντας τη λειτουργία των νησιδίων-Langerhans και του αγγειακού ενδοθηλίου. Υλικά και μέθοδοι Σε αυτήν την μελέτη χρησιμοποιήθηκαν αρσενικοί αρουραίοι Wistar (205 - 250g). Ο διαβήτης επάγεται μέσω μιας ενδοπεριτοναϊκής έγχυσης στρεπτοζοτοκίνης (STZ 65mg/kg). Τα ζώα θεωρηθήκαν ως διαβητικά εάν τα επίπεδα γλυκόζης αίματός τους ήταν μεγαλύτερα από 200 mg/dl. Διεξήχθησαν δύο σειρές πειραμάτων, κάθε μια από τις οποίες διάρκεσε οκτώ ημέρες. Στην 1 8 πρώτη σειρά πειραμάτων οι αρουραίοι χωρίσθηκαν σε τρεις ομάδες: αρουραίοι ελέγχου, οι μή λαμβάνοντες θεραπεία διαβητικοί αρουραίοι και οι διαβητικοί αρουραίοι που ελάμβαναν θεραπεία με Losartan (20 mg κλ-1 ημέρα-1). Στη δεύτερη σειρά πειραμάτων οι αρουραίοι χωρίσθηκαν σε πέντε ομάδες: οι αρουραίοι ελέγχου, οι μη λαμβάνοντες θεραπεία διαβητικοί αρουραίοι και τρεις ομάδες διαβητικών αρουραίων λαμβάνοντες θεραπεία με 3.5, 7 και 10.5 mg κλ-1 ημέρα-1 Rolipram, αντίστοιχα. Το Rolipram ήταν μια προσφορά της εταιρίας Shering (Βερολίνο Γερμανία). Η γλυκόζη αίματος και το σωματικό βάρος προσδιορίζονταν ως δείκτες της μεταβολικής κατάστασης κατά την 0, 3, 7 και 11 ημέρες μετά από τη χορήγηση STZ. Στο τέλος και των δύο πειραμάτων οι αρουραίοι θυσιάστηκαν με αποκεφαλισμό. Το αίμα και το πάγκρεας απομονώθηκαν για περαιτέρω ανάλυση. Η βαθμολόγηση της καταστροφής των νησιδίων εκτελέσθηκε χρησιμοποιώντας τομές παγκρέατος σε παραφίνη και χρωματίσθηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη. Ο αριθμός των βήτα-κύτταρων που παράγουν ινσουλίνη υπολογίσθηκε ανοσοϊστοχημικά από το ποσοστό της επιφάνειας των νησιδίων καθώς της συνολικής επιφάνειας των παγκρεατικών τομών που ήταν θετικές στα αντισώματα ινσουλίνης