Μηχανισμοί μεταγραφικής ρύθμισης του γονιδίου sr-bi του ανθρώπου

Abstract

Scavenger receptor class B type I (SR-BI) facilitates the reverse transport of excess cholesterol from peripheral tissues to the liver via high-density lipoproteins. In steroidogenic tissues, SR-BI supplies cholesterol for steroid hormone production. In the present thesis, we focused on the role of hormone nuclear receptors in human SR-BI gene regulation in hepatic, adrenal and ovarian cells. We show that the transcription of the human SR-BI gene is subject to feedback inhibition by glucocorticoids in adrenal and ovarian cells. SR-BI mRNA levels were increased in adrenals from corticosterone-insufficient mice, whereas corticosterone replacement by oral administration inhibited SR-BI gene expression in these mice. SR-BI mRNA levels were increased in adrenals from wild-type mice treated with metyrapone, a drug that blocks corticosterone synthesis. Experiments in adrenocortical H295R and ovarian SKOV-3 cells using cycloheximide and siRNA-mediated gene silencing revealed that glucocorticoidmediated inhibition of SR-BI gene transcription requires de novo protein synthesis and the glucocorticoid receptor (GR). No direct binding of GR to the SRBI promoter could be demonstrated in vitro and in vivo, suggesting an indirect mechanism of repression of SR-BI gene transcription by GR in adrenal cells. Deletion analysis established that the region of the human SR-BI promoter between nucleotides -201 and -62 is sufficient to mediate repression by 11 glucocorticoids. This region contains putative binding sites for transcriptional repressors that could play a role in SR-BI gene regulation in response to glucocorticoids. In hepatic cells, SR-BI is regulated by an interplay of multiple hepatocytespecific transcription factors such as Hepatocyte Nuclear Factor 3β (HNF-3β or FOXA2) and the orphan nuclear receptor Hepatocyte Nuclear Factor 4 (HNF-4). Using the human hepatoblastoma HepG2 cells and a model system, we showed that the activity of the hSR-BI promoter is subject to negative regulation by HNF- 4. These data are in agreement with previous studies which had shown that inactivation of the HNF-4 gene in the mouse is associated with a drastic increase in hepatic SR-BI levels. Silencing of the endogenous HNF-4 gene in HepG2 cells by shRNA increased the SR-BI mRNA levels whereas overexpression of HNF-4 repressed endogenous SR-BI gene expression. Promoter deletion analysis established that the region of the human SR-BI promoter between nucleotides - 201 and -62 is sufficient to mediate repression by HNF-4. By in vitro and in vivo protein-DNA interaction assays we demonstrated recruitment of HNF-4 to multiple sites on the hSR-BI promoter, suggesting a direct mechanism of repression of SR-BI gene transcription by HNF-4 in the liver.

Ο υποδοχέας εκκαθαριστής τάξης Β τύπου Ι (SR-BI) διαμεσολαβεί στην αντίστροφη μεταφορά της περίσσειας χοληστερόλης από τους περιφερικούς ιστούς στο ήπαρ μέσω των λιποπρωτεϊνών υψηλής πυκνότητας (HDL). Στους στεροειδογενείς ιστούς ο SR-BI παρέχει χοληστερόλη για την σύνθεση στεροειδών ορμονών. Στην παρούσα διατριβή επικεντρωθήκαμε στον ρόλο των ορμονικών πυρηνικών υποδοχέων στην ρύθμιση του γονίδιου SR-BI του ανθρώπου σε ηπατικά, επινεφριδιακά κύτταρα και κύτταρα ωοθηκών. Δείξαμε ότι η μεταγραφή του γονιδίου SR-BI του ανθρώπου υπόκειται σε ανάστροφη καταστολή από τα γλυκοκορτικοειδή σε επινεφριδιακά κύτταρα και κύτταρα ωοθηκών. Τα επίπεδα mRNA του SR-BI αυξήθηκαν στα επινεφρίδια ποντικών με ανεπάρκεια κορτικοστερόνης, ενώ η από του στόματος αποκατάσταση της κορτικοστερόνης κατέστειλε την έκφραση του γονιδίου του SR-BI σε αυτούς τούς ποντικούς. Τα επίπεδα mRNA του SR-BI αυξήθηκαν στα επινεφρίδια αγρίου τύπου ποντικών στους οποίους είχε χορηγηθεί μετυραπόνη, ένα φάρμακο το οποίο παρεμποδίζει την σύνθεση της κορτικοστερόνης. Πειράματα σε επινεφριδιακά κύτταρα H295R και σε κύτταρα ωοθηκών SKOV-3 με τη χρήση κυκλοεξιμίδης και με γονιδιακή αποσιώπηση μέσω siRNA, έδειξαν ότι η καταστολή της μεταγραφής του γονιδίου SR-BI από τα γλυκοκορτικοειδή χρειάζεται de novo πρωτεϊνοσύνθεση, καθώς και τον υποδοχέα των γλυκοκορτικοειδών (GR). Σε αναλύσεις in vitro και in vivo αλληλεπίδρασης πρωτεΐνης-DNA δεν δείχθηκε άμεση πρόσδεση του υποδοχέα των γλυκοκορτικοειδών στον υποκινητή του γονιδίου SR-BI, γεγονός που 14 υποδεικνύει έναν έμμεσο μηχανισμό καταστολής της μεταγραφής του από τα γλυκοκορτικοειδή σε επινεφριδιακά κύτταρα. Η ανάλυση ελλειμματικών μορφών του υποκινητή του γονιδίου SR-BI έδειξε ότι η περιοχή μεταξύ των νουκλεοτιδίων -201 και -62 επαρκεί για την καταστολή από τα γλυκοκορτικοειδή. Αυτή η περιοχή περιέχει πιθανές θέσεις πρόσδεσης μεταγραφικών καταστολέων οι οποίοι πιθανώς να διαδραματίζουν ρόλο στην ρύθμιση του γονιδίου SR-BI του ανθρώπου ως απόκριση στα γλυκοκορτικοειδή. Σε ηπατικά κύτταρα, ο SR-BI ρυθμίζεται από αλληλεπιδράσεις μεταξύ πολλαπλών ηπατο-ειδικών μεταγραφικών παραγόντων, όπως ο Hepatocyte Nuclear Factor 3β (HNF-3β/FOXA2) και ο ορφανός πυρηνικός υποδοχέας Hepatocyte Nuclear Factor 4 (HNF-4). Χρησιμοποιώντας τα κύτταρα ηπατοβλαστώματος ανθρώπου HepG2 ως σύστημα μοντέλο, δείξαμε ότι η ενεργότητα του υποκινητή του γονιδίου hSR-BI υπόκειται σε αρνητική ρύθμιση από τον HNF-4. Αυτά τα ευρήματα είναι σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες οι οποίες έδειξαν ότι η απενεργοποίηση του γονιδίου του HNF-4 σε ποντικούς σχετίζεται με την δραματική αύξηση στα επίπεδα mRNA του γονιδίου SR-BI στο ήπαρ.