Ποιοτική και ποσοτική εκτίμηση της παρουσίας εμβρυϊκών στοιχείων στο αίμα της μητέρας κατά τη διάρκεια φυσιολογικών και παθολογικών κυήσεων

Abstract

We describe two methods for isolation of nucleated fetal red blood cells from peripheral maternal blood. These cells could be used for early prenatal diagnosis. For the first group of the study we used MACS. The twenty pregnant women who participated in the first group were between 8 and 14 weeks of gestation (mean 10.8), and had low risk for Down syndrome according to their age (between 21 to 34 years old and mean 28.1). We have used 20 mls from maternal peripheral blood. After gradient centrifugation and removal of the mononuclear cell layer we have performed magnetic cell sorting twice by using the glycophorin A antibody and secondary antibody conjugated with magnetic beads. The positive cells have been held on the magnet and were maternal and fetal red cells. We have then added on the positive cells the monoclonal antibody for γ-chain and the fetal nucleated erythrocytes have been measured under light microscope. The number of fetal erythrocytes we have counted was between 0 and 18, with mean number of 7.2, SD 5.2 and SEM 1.17. We have managed to find these cell s on the 18 out of 20 cases (90%). The second group of women who participated in our study consisted of 15 pregnant women between 8 and 14 weeks of gestation. In this group we used 20 mls of peripheral maternal blood and performed flow cytometry. After gradient centrifugation and removal of the mononuclear cell layer we have added the antibodies CD 45 ECD, CD 41 PE, GlycA PE and anti γ-FITC and performed flow cytometry. The isolated population of cells was CD45-, CD41-, GlycA+, IGγ+ and contains the nucleated red blood fetal cells. The mean number of the isolated cells were 1138 (363-2560), SD 631.6 and SEM 163. The percentage of the isolated cells to the total cell population was 0 .8% to 4 .2% (mean 1 .7%, SD 0.6). The aim of our study was to identify the nucleated red fetal blood cells in maternal blood. We have identified all the obstacles encountered in our experiments and we have finally managed to develop a reliable method for non invasive isolation of fetal cells from maternal peripheral blood. Despite the difficulties our current protocols seem to enable the isolation of the few nucleated fetal red blood cells from the maternal circulation in most samples.

Περιγράφουμε δύο μεθόδους απομόνωσης εμπύρηνων εμβρυϊκών αιμοσφαιρίων από το περιφερικό αίμα εγκύων γυναικών, οι οποίες θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για πρώιμο προγεννητικό έλεγχο. Στην πρώτη ομάδα χρησιμοποιήθηκε μαγνητικός διαχωρισμός. Έγινε λήψη περιφερικού αίματος από 20 έγκυες γυναίκες 8 έως 14 εβδομάδων κύησης, χαμηλού κινδύνου για σύνδρομο DOWN, με βάση την ηλικία τους. Ακολούθησε επεξεργασία με βαθμίδωση πυκνότητας, λήψη της υπόλευκης στοιβάδας των μονοκυττάρων, επώαση με μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι της γλυκοφορίνης Α και μαγνητικός διαχωρισμός. Τα εμπύρηνα ερυθρά αιμοσφαίρια, τόσο μητρικής, όσο και εμβρυϊκής προέλευσης συγκρατήθηκαν από το μαγνήτη. Στη συνέχεια προστέθηκε μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι της γ-αλυσίδας της αιμοσφαιρίνης και ακολούθησε εξέταση και καταμέτρηση των θετικών εμπύρηνων εμβρυϊκών ερυθρών. Οι εγκυμοσύνες ήταν μεταξύ της 8ης έως της 14ης εβδομάδας (μέση εβδομάδα κύησης 10.8). Ο μέσος όρος ηλικίας των εγκύων ήταν 28.1 (από 21 έως 34 χρονών). Ο αριθμός των εμπύρηνων εμβρυϊκών ερυθρών κυττάρων που ανιχνεύθηκαν στο οπτικό μικροσκόπιο ήταν από 0 έως 18, με μέσο όρο 7.2, SD και SEM 1.17. Το ποσοστό ανίχνευσης κυττάρων ήταν 90% (18/20). Για την πραγματοποίηση του πειράματος με κυτταρομετρία ροής έγινε λήψη 20ml αίματος από 15 έγκυες γυναίκες, με ηλικία κύησης από 8 έως 14 εβδομάδες. Ακολούθησε επώαση του αίματος, φυγοκέντρηση και στη συνέχεια αφαίρεση της στοιβάδας των PBMCs. Στη συνέχεια έγινε επώαση ποσότητας του δείγματος με συγκεκριμένα αντιγόνα το CD 45 ECD, το CD 41 PE, τη GlycA PE και το IGγ-FITC. Ο πληθυσμός των κυττάρων που απομονώσαμε δηλαδή ήταν CD45-, CD41-, GlycA+ και anti γ+ και περιέχει τα εμπύρηνα εμβρυϊκά ερυθρά. Ο τελικός αριθμός του πληθυσμού των απομονωμένων κυττάρων είχε μέση τιμή 1138 (363-2560), SD 631.6 και SEM 163. Το ποσοστό των απομονωμένων κυττάρων σε σχέση με τον αρχικό πληθυσμό ήταν από 0.8% έως 4.2% (μέση τιμή 1.7%, SD 0.6). Η έρευνα μας αποσκοπούσε στην ακριβή αναγνώριση των εμβρυϊκών εμπύρηνων ερυθρών στην κυκλοφορία της μητέρας. Παρά τις δυσκολίες φαίνεται πως τα πρωτόκολλά μας συντέλεσαν στην απομόνωση με επιτυχία των λίγων εμπύρηνων εμβρυϊκών ερυθρών από το αίμα των εγκύων στα περισσότερα δείγματα.