Μοριακή μελέτη της απόπτωσης των λευχαιμικών κυττάρων σε ηλικιωμένους ασθενείς με οξεία μυελογενή λευχαιμία

Abstract

Acute Myeloid Leukemia (AML) is a complex disease with considerabe phenotypical and genotypical heterogeneity. More than 50% of patients with AM are over 60 years-of-age. Age is one of the most important adverse prognostic factors and the optimal therapy of AML in elderly patients remains a controversial issue. Several biologic features of AML differ between older and younger individuals. Older patients often express multidrug resistant phenotype and cytogenic abnormalities, which may be responsible in large part for the poor outcomes observed in older-aged subgroups. Traditional cytotoxic chemotherapy is associated with a low complete response rate and a high treatment-related mortality in older patients, which explains in large part the poorer outcomes observed in individuals over 60 years of age. For that reason, treatment for the elderly AML patients should be based on biologic and prognostic factors. Research into the pathophysiology of AML has revealed and abundance of intracellular signaling events that govern proliferation, differentiation, self-renewal and apoptosis. Apoptosis, or programmed cell death, is the mechanism which controls the balance between cell death and cell proliferation and acts to preserve homeostasis in tissues. Survivin is a member of the inhibitor of apoptosis protein (IAP) family and is characterized as a bi-functional protein, implicated in both regulation of cell division and inhibition of apoptosis. Unlike othe IAPs, surviving is expressed primarily in fetal but not adult tissues and its expression is aberrantly enhanced in most cancers. Survivin takes part in cancer progression and resistance to therapy, in diverse tumour types and haematologic malignancies. Therefore, it has been proposed that surviving could be used as a prognostic marker or a cancer therapeutic target, especially in cases where conventional cytotoxic chemotherapy is associated with serious adverse effects and cannot be well tolerated. A surviving-antisense approach would be expected to carry limited toxicity for normal cells and therefore, it could be more tolerable by elderly patients. In this study, surviving expression was examined in elderly AML patients at diagnosis and in complete remission after chemotherapy and was correlated with the expression in control individuals. The semi-quantitative evaluation of the mRNA expression was performed, in both bone marrow and peripheral blood cells, with the use of the Real-Time RT-PCR method, while serum protein levels were estimated with the use of immunoassay technique ELISA. Real-Time RT-PCR is an extremely sensitive, precise and accurate method, which is used for the quantitative determination of mRNA levels, even when a genes’s expression is rather low. Futhermore, the expression of surviving, in both mRNA and protein level was correlated with well-known prognostic factors for AML (such as age, FAB classification, karyotype and type of leukemia) and the response to chemotherapy. In the present study, survivin expression was detected in all elderly AML patients at diagnosis and in complete remission, in both protein and mRNA level. Moreover, survivin mRNA levels were found in bone marrow cells of all control individuals, while Real-Time RT-PCR method revealed low mRNA expression levels in peripheral blood cells of the control individuals. In bone marrow cells, mRNA expression was significantly lower, compared to control individuals, while in peripheral blood cells, both mRNA and protein levels were significantly higher. In patients in complete remission, both mRNA and protein levels were similar and not significantly different from the levels in control group. High mRNA expression levels in bone marrow cells were significantly correlated with unfavourable karyotype, unfavourable type of FAB classification and secondary AML, while high mRNA levels in peripheral blood cells were significantly correlated with unfavourable karyotype and failure to achieve complete remission. Finally, high serum protein levels were significantly correlated with failure to response in chemotherapy. From the present study, it is not clear whether surviving could be used as a potential molecular target for the therapeutic approach of AML. However, it is shown that the study of surviving expression, primarily in peripheral blood cells, could be used as an unfavourable prognostic marker, a marker of resistance in chemotherapeutic drugs or a minimal residual disease indicator.

Η Οξεία Μυελογενής Λευχαιμία (ΟΜΛ) είναι μία κακοήθης νόσος του αιμοποιητικού συστήματος, που προσβάλει σε ποσοστό μεγαλύτερο του 50%, ήλικιωμένα άτομα. Οι ηλικιωμένοι ασθενείς με ΟΜΛ φέρουν ιδιαίτερα βιολογικά γνωρίσματα που τους διαφοροποιούν από τους νεότερους ασθενείς και τους καθιστούν μια ξεχωριστή ομάδα. Τα βιολογικά αυτά γνωρίσματα σχετίζονται συνήθως με δυσμενή πρόγνωση και με αντίσταση στη χημειοθεραπευτική αγωγή, με αποτέλεσμα οι ηλικιωμένοι ασθενείς να εμφανίζουν αδυναμία απάντησης στη θεραπεία και χαμηλά ποσοστά πλήρους ύφεσης. Για τον λόγο αυτόν είναι απαραίτητο να βρεθούν νέες θεραπευτικές προσεγγίσεις, λιγότερο τοξικές, που θα υπερπηδούν δυσμενείς προγνωστικούς παράγοντεςκαι θα οδηγούν με ασφάλεια στην ύφεση της ΟΜΛ στους ηλικιωμένους. Για την επίτευξη αυτού του σκοπού, πρέπει να μελετηθεί σε βάθος η παθογένεια της ΟΜΛ και να καθοριστούν οι παράγοντες που διέπουν τους ενδοκυττάριους μοριακούς μηχανισμούς της λευχαιμογένεσης, κυρίως αυτής των ηλικιωμένων ασθενών. Σήμερα θεωρείται ότι η ΟΜΛ προκαλείται από διαταραχή της ισορροπίας μεταξύ της αυτοανανέωσης, της διαφοροποίησης και της απόπτωσης των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων του μυελού των οστών. Η απόπτωση, ή αλλιώς ο προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος είναι ο μηχανισμός που ρυθμίζει την ισορροπία μεταξύ του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και του κυτταρικού θανάτου, με τελικό στόχο τη διατήρηση της ομοιόστασης των ιστών. Η μειωμένη ικανότητα των λευχαιμικών κυττάρων να εκτελούν απόπτωση έχει αναγνωριστεί ως ένας σημαντικός μηχανισμός, που προωθεί την αύξηση και ανάπτυξη του λευχαιμικού κλώνου. Οι IAPs (Inhibition of Apoptosis Protein family) αποτελούν μια οικογένεια αναστολέων της απόπτωσης, που τελευταία έχει δειχθεί ότι παίζουν σημαντικό ρόλο στην αναστολή της απόπτωσης σε διάφορα κακοήθ αιματολογικά νοσήματα. Η surviving αποτελεί το μικρότερο και νεότερο μέλος της οικογένειας των IAPs και έχει διττό ρόλο, διότι συμμετέχει τόσο στην αναστολή της απόπτωσης, όσο και στην προαγωγή τα κυτταρικής διαίρεσης, αποτελώντας ένα σημαντικό αποπτωτικό σημείο ελέγχου κατά τη διάρκεια της μίτωσης. Η surviving παρουσιάζει ιδιαίτερο ενδιαφέρον καθώς υπερεκφράζεται στα περισσότερα καρκινικά κύτταρα του ανθρώπου, αλλά δεν ανιχνεύεται σε τελικά διαφοροποιημένους φυσιολογικούς ιστούς. Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η έκφραση της survivin σε ηλικιωμένους ασθενείς με ΟΜΛ, που αποτελούν μια ευαίσθητη και βιολογικά διακριτή ομάδα, η οποία δεν έχει μελετηθεί ιδιαίτερα έως τώρα. Η μελέτη της έκφρασης έγινε κατά τη διάγνωση της νόσου και κατά την πλήρη αιματολογική ύφεση, μετά από χημειοθεραπεία και συσχετίσθηκε με την έκφραση των φυσιολογικών ατόμων. Η μελέτη της έκφρασης της survivin σε ασθενείς με ΟΜΛ πραγματοποιήθηκε για πρώτη φορά, τόσο σε επίπεδο mRNA, με τη μέθοδο της Real-Time RT-PCR (στον μυελό των οστών και στο περιφερικό αίμα), όσο και σε πρωτεϊνικό επίπεδο, με την ανοσοενζυμική μέθοδο ELISA. Η Real-Time RT-PCR αποτελεί μια ιδιαίτερα ακριβή και ευαίσθητη μέθοδο ποσοτικού προσδιορισμού που χρησιμοποιείται για τη μελέτη της έκφρασης των επιπέδων mRNA ενός γονιδίου, ακόμη και στις περιπτώσεις που αυτή είναι πολύ χαμηλή. Στην παρούσα μελέτη, η έκφραση της survivin συσχετίσθηκε με γνωστούς προγνωστικούς παράγοντες για την ΟΜΛ (όπως η ηλικία, η ταξινόμηση κατά FAB, ο καρυότυπος και ο τύπος της λευχαιμίας) και την απάντηση των ασθενών στη χημειοθεραπεία, προκειμένου να διαπιστωθεί εάν η survivin μπορεί να αποτελέσει έναν δυσμενή προγνωστικό παράγοντα για την πορεία της ΟΜΛ και έναν δείκτη ανθεκτικότητας στη χημειοθεραπεία ή υποκείμενης υποτροπής. Από τη μελέτη αυτή προέκυψε ότι η surviving εκφράζεται σε όλους τους ηλικιωμένους ασθενείς με ΟΜΛ κατά τη διάγνωση της νόσου, τόσο σε επίπεδο mRNA, όσο και σε πρωτεϊνικό επίπεδο. Επιπλέον, βρέθηκε ότι η surviving εκφράζεται σε επίπεδο mRNA στο μυελό των οστών όλων των φυσιολογικών ατόμων, ενώ η μέθοδος της Real-Time RT-PCR αποκάλυψε τη χαμηλή έκφραση επιπέδων mRNA και στο περιφερικό αίμα των ατόμων αυτών. Στον μυελό των οστών, η έκφραση της surviving (επίπεδα mRNA) ήταν σημαντικά χαμηλότερη σε σχέση με τους μάρτυρες, ενώ στο περιφερικό αίμα (επίπεδα mRNA και συγκέντρωση πρωτεΐνης) ήταν σημαντικά υψηλότερη. Στους ασθενείς σε πλήρη αιματολογική ύφεση τα επίπεδα mRNA, καθώς και η συγκέντρωση της πρωτεΐνης ήταν σε κάθε περίπτωση παρόμοια με αυτά των μαρτύρων. Επίσης, στην παρούσα μελέτη βρέθηκε ότι, αυξημένα επίπεδα mRNA της surviving στον μυελό των οστών συσχετίζονται σημαντικά με δυσμενή καρυότυπο, δυσμενή τύπο της ταξινόμησης κατά FAB και με δευτεροπαθή ΟΜΛ, ενώ τα αντίστοιχα επίπεδα του περιφερικού αίματος συσχετίζονται σημαντικά με δυσμενή καρυότυπο και με αδυναμία επίτευξης πλήρους ύφεσης. Τέλος, υψηλή συγκέντρωση πρωτεΐνης στο ορό σχετίζεται σημαντικά με αδυναμία απάντησης των ασθενών στη θεραπεία και αδυναμία επίτευξης πλήρους ύφεσης. Από την παρούσα μελέτη δεν προέκυψαν σαφή συμπεράσματα για τον αν η surviving μπορεί να αποτελέσει έναν μοριακό στόχο για τη θεραπευτική προσέγγιση της ΟΜΛ. Ωστόσο, διαπιστώθηκε ότι η μελέτη της έκφρασης της survivin, κυρίως στο περιφερικό αίμα μπορεί να αποτελέσει έναν αξιόπιστο δείκτη της ενεργότητας της νόσου και της αντίστασης στη χημειοθεραπευτική αγωγή και έναν δυσμενή προγνωστικό παράγοντα για την πορεία της ΟΜΛ.