Διερεύνηση του ρόλου του μεταγραφικού παράγοντα FKLF1 στον αιμοποιητικό και άλλους ιστούς

Abstract

FKLF1 is a transcription factor of the Krüpel-Like Factors (KLF) family, which includes factors with important identified roles in hemopoietic and most other tissues examined. Among them EKLF, which is necessary for the fetal to adult hemoglobin switching and TIEG1, a close relative of FKLF1, that participates in bone formation and has anti-proliferative effects and reduced levels in breast and prostate cancer. In previous studies FKLF1 has been shown to be involved in TGF-β1’s apoptotic and anti-proliferative pathway. Its over-expression in pancreatic cells leads to inhibition of their growth and to transcriptional activation of the pro-insulin gene. Ηowever, only a minor role of one of its gene polymorphisms has been identified in diabetes. It may also have a role in bone disease, such as osteopenia and osteoporosis and in hypertrophic cardiomyopathy. FKLF1 is capable of inducing the ε, γ and, less, β globin gene promoters in cell lines, in vitro. It may also have anti-oncogenic actions in breast and prostate cancer. Our study examined its function in four ways: a) By inserting it, though a retroviral vector in cell lines and hemopoietic progenitors, the latter examined by cell culture, in vitro and in mouse transplantation experiments in vivo. b) In mouse gene knockout and c) transgenic over-expression experiments and d) by testing its expression in several normal mouse and normal and neoplastic human tissues. The above experiments have shown that: • FKLF1 is a transcriptional repressor of hemopoiesis that, when over-expressed in transgenic mice, inhibits both erythroid maturation beyond the proerythroblast stage and other hemopoietic cell line proliferation and/or maturation. It also increases human erythroid γ globin expression in vitro and in vivo in adult mice after progenitor transduction via a retroviral vector which is a proof of principle that a transcription factor could prove useful in gene therapy of the hemoglobinopathies. However it does not seem to have a physiologic role in β globin gene locus control, as shown in the transgenic over-expression and gene knockout mouse models. Moreover it appears to be redundant for most mouse tissues, where it is normally expressed, since its absence has little or no consequence both in mouse development and survival as in hematologic parameters and resistance to oncogenic stimuli (e.g. ionizing irradiation). Our tissue expression analysis showed that: i) It is stably expressed in the peripheral blood of healthy blood donors. ii) There is no difference in its expression between normal and neoplastic tissue samples from patients with lung cancer. iii) Most interestingly, it is frequently absent or seriously reduced in the bone marrow of human acute lymphoblastic leukemia of children, where its role must be further elucidated.

Ο FKLF1 είναι ένας μεταγραφικός παράγοντας της οικογένειας των Krüpel-Like Factors (KLF), η οποία έχει μέλη με εξακριβωμένες, σημαντικές δράσεις στον αιμοποιητικό και σχεδόν όλους τους ιστούς που έχουν μελετηθεί. Μεταξύ αυτών ο EKLF ο οποίος είναι απαραίτητος για τη στροφή από την εμβρυϊκή στην αιμοσφαιρίνη των ενηλίκων και ο TIEG1, στενός συγγενής του FKLF1, ο οποίος συμμετέχει στη διαμόρφωση των οστών κι έχει αντιπολλαπλασιαστική δράση, με τα επίπεδά του να είναι μειωμένα στον καρκίνο του μαστού και του προστάτη. Ο FKLF1 σε προηγούμενες μελέτες έχει φανεί να συμμετέχει στην αποπτωτική και αντι-πολλαπλασιαστική οδό του TGF-β1 και η υπερέκφρασή του σε κύτταρα παγκρέατος οδηγεί σε καταστολή του πολλαπλασιασμού τους και σε μεταγραφική ενεργοποίηση του γονιδίου της προϊνσουλίνης, χωρίς, ωστόσο, να έχει εξακριβωθεί εμπλοκή του στην παθογένεση του σακχαρώδη διαβήτη, πέραν, ίσως, ενός ελάσσονος ρόλου ενός πολυμορφισμού του. Πιθανολογείται επίσης εμπλοκή διαταραχών του στη δημιουργία οστικής νόσου, όπως οστεοπενία και οστεοπόρωση και στην πρόκληση υπερτροφικής καρδιομυοπάθειας.. Ο FKLF1 έχει επίσης την ικανότητα να επάγει την έκφραση της ε, γ και λιγότερο της β αλύσου της αιμοσφαιρίνης, κινητοποιώντας τους προαγωγείς τους σε πειράματα σε κυτταρικές σειρές, in vitro. Είναι πιθανή επίσης κάποια ογκοκατασταλτική του δράση στον καρκίνο του μαστού και του προστάτη. Η μελέτη μας εξέτασε τη δράση του με τέσσερις τρόπους: α) με την εισαγωγή του, με τη χρήση ρετροιϊκού φορέα, σε κυτταρικές σειρές και σε προγονικά αιμοποιητικό. κύτταρα, που καλλιεργήθηκαν in vitro και μεταμοσχεύτηκαν σε ποντικούς, για μελέτη τους in vivo, β) με απαλειφή του (knockout) σε ποντικούς in vivo, γ) με υπερέκφρασή του σε διαγονιδιακούς ποντικούς in vivo και δ) με μελέτη της έκφρασής του σε φυσιολογικούς ιστούς ποντικού και σε φυσιολογικούς και νεοπλασματικούς ιστούς ανθρώπου. Με τους τρόπους αυτούς δείξαμε ότι: • ο FKLF1 είναι ένας καταστολέας της αιμοποίησης που, όταν υπερεκφράζεται σε διαγονιδιακούς ποντικούς, σταματά την ερυθροκυτταρική ωρίμανση στο στάδιο του προερυθροβλάστη και αναστέλλει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και/ ή την ωρίμανση όλων των αμοποιητικών σειρών. • Αυξάνει την έκφραση της γ αλύσου της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης όταν χορηγείται μέσω ρετροϊικού φορέα σε ενήλικους ποντικούς in vitro και in vivo, γεγονός που αποτελεί απόδειξη αρχής ότι ένας μεταγραφικός παράγοντας θα μπορούσε να καταστεί χρήσιμος στη γονιδιακή θεραπεία των αιμοσφαιρινοπαθειών. • Δεν φαίνεται να έχει φυσιολογικό ρόλο στη ρύθμιση των γονιδίων της γονιδιωματικής περιοχής της β αλύσου της αιμοσφαιρίνης, όπως φάνηκε από πειράματα υπερέκφρασης και σίγασής του σε διαγονιδιακούς ποντικούς. • Εκτός από τον αιμοποιητικό εκφράζεται και σε πολλούς άλλους ιστούς ποντικού, όπου όμως δε φαίνεται να είναι απαραίτητος, καθότι ποντικοί με σίγασή του αναπτύσσονται φυσιολογικά, τόσο όσον αφορά τη σωματική τους ανάπτυξη και επιβίωση όσο και τις αιματολογικές τους παραμέτρους και την αντίδρασή τους σε ογκογόνα ερεθίσματα, όπως ιονίζουσα ακτινοβολία. • Σε πειράματα σε ανθρώπινους ιστούς, φάνηκε να: i) Εκφράζεται σταθερά και με παρόμοια ένταση στο περιφερικό αίμα υγειών αιμοδοτών. ii) Εμφανίζει παρόμοια έκφραση σε φυσιολογικά και καρκινικά ιστολογικά δείγματα ασθενών με καρκίνο πνεύμονα, iii) Απουσιάζει ή να είναι ελαττωμένος συχνά σε μυελό των οστών παιδιών με οξεία λεμφοβλαστική λευχαιμία, όπου πρέπει να ξεκαθαριστεί περαιτέρω ο φυσιολογικός του ρόλος.