Η μελέτη της claspin στον καρκίνο

Abstract

Claspin is a nuclear protein involved in DNA replication and DNA damage response. It may represent a potentially useful proliferation marker. A novel monoclonal antibody against human Claspin was created and its expression was investigated in normal and neoplastic cell populations both in vivo and in vitro. Material-Methods: Tumour and adjacent normal tissues were obtained from patients with non-small-cell-lung carcinoma (49), colonic adenocarcinoma (18) ,transitional cell carcinoma of the bladder (31) and ductal breast carcinomas (52). The samples were analysed by immunohistochemistry and immunofluorescence. Ki67 expression was also examined in these tissues. Additionally, Claspin and cyclin A expression was assessed by immunoblotting in normal lung fibroblasts (DLFs) and various cancer cell lines (Saos2, A549, HT-29 and HCT116). Finally, functional assays were performed in synchronized DLFs and in a tetracycline-inducible Saos2-p21 variant Results-Conclusions: Immunoblot analysis confirmed the specificity of the generated antibody. In addition, immunohistochemistry was shown to be effective in archival material demonstrating a clear nuclear signal. In normal cells Claspin expression was weak, whereas increased levels were observed in cancer. Claspin labeling index was higher in tumors (p<0.001). Claspin expression strongly correlated with Ki67 expression in normal (p<0.001) and tumor tissues (p<0.001). Claspin LI was consistently lower than Ki67 LI in both normal (p=0.001) and tumor tissues (p<0.001), suggesting that its expression during the cell cycle may be limited to a narrower time-frame. Indeed, co-localization assays with cyclin A and cell synchronization experiments indicated that Claspin expression coincides with the early period of S-phase. Finally, the relative increase of the Claspin LI in the tumor samples compared to the normal ones was significantly higher (14-fold) than that of Ki67 (5-fold) implying a role of the former in the response to replication stress developed during carcinogenesis. These findings suggest that Claspin expression, as assessed by the use of a newly created monoclonal antibody, may serve as a potentially useful S phase-specific marker, as well as a marker of replication stress in both neoplastic and normal tissues.

Η κλασπίνη είναι μία πυρηνική πρωτεΐνη που συμμετέχει στην φυσιολογική αντιγραφή του DNA. Συμβάλλει ακόμη στην κυτταρική ανταπόκριση σε βλάβες του DNA. Ενδέχεται να αποτελεί ένα χρήσιμο και ειδικό δείκτη κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Στη παρούσα μελέτη συνετέθη ένα νέο μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι της κλασπίνης και διερευνήθηκε για πρώτη φορά η έκφρασή της σε πολλαπλασιαζόμενα φυσιολογικά και καρκινικά κύτταρα. Υλικό-Μέθοδοι: Εφαρμόστηκε ανοσοϊστοχημεία και έμμεσο ανοσοφθορισμό για την ανοσοεντόπιση της κλασπίνης σε τομές παραφίνης από 49 δείγματα μη-μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα, 18 αδενοκαρκινώματα παχέος εντέρου, 31 καρκινώματα μεταβατικού επιθηλίου της ουροδόχου κύστεως, 52 πορώδη καρκινώματα του μαστού και στα αντίστοιχα φυσιολογικά τους. Στα ίδια δείγματα εκτιμήθηκε και ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός με ανοσοϊστοχημεία έναντι του Ki67. Επιπλέον, χρησιμοποιήθηκαν πρωτογενείς φυσιολογικοί πνευμονικοί ινοβλάστες (DLFs) και ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές (HCT-116, HT-29, A549 και Saos-2), για τη μελέτη της έκφρασης της κλασπίνης και της κυκλίνης Α με μεθόδους ανοσοεντόπισης. Τέλος, πραγματοποιήθηκε λειτουργική ανάλυση σε συγχρονισμένους DLFs και το επαγώγιμο κυτταρικό σύστημα Saos2-p21 Tet/ON. Αποτελέσματα-Συμπεράσματα: Η εφαρμογή στυπώματος Western επιβεβαίωσε την ειδικότητα του αντισώματος έναντι της κλασπίνης, με την ανίχνευση μιας ξεκάθαρης ζώνης στο ύψος των 250 kDa. Η ανοσοϊστοχημεία στις τομές παραφίνης ήταν επιτυχής, και παρατηρήθηκε μια σαφής, αμιγώς πυρηνική ανοσοχρώση. Η έκφραση της κλασπίνης στους φυσιολογικούς ιστούς ήταν ασθενής, ενώ στους όγκους ήταν σημαντικά υψηλότερη (p<0.001). Η σχετική αύξηση του δείκτη σήμανσης στους όγκους ήταν σημαντικά εντονότερη για την κλασπίνη (14 φορές) απ’ότι για το Ki67 (5 φορές), παρατήρηση που είναι πιθανό να οφείλεται στην απάντηση της κλασπίνης έναντι του αντιγραφικού στρες που διέπει τα καρκινικά κυττάρα. Το ποσοστό των σεσημασμένων για κλασπίνη κυττάρων βρέθηκε να έχει ισχυρή, γραμμική συσχέτιση με το ποσοστό των σεσημασμένων για Ki67 κυττάρων τόσο στους φυσιολογικούς (p<0.001), όσο και στους καρκινικούς ιστούς (p<0.001). Συνολικά, το ποσοστό σήμανσης της κλασπίνης ήταν σταθερά χαμηλότερο από το ποσοστό σήμανσης του Ki67 τόσο στους φυσιολογικούς (p=0.001), όσο και στους καρκινικούς ιστούς (p<0.001), υποδεικνύοντας έτσι την περισσότερο ειδική έκφρασή της σε μέρος του κυτταρικού κύκλου. Πράγματι, η έκφραση της κλασπίνης σε πειράματα κυτταρικού συγχρονισμού συμβαδίζει με τα πρώιμα στάδια της φάσης S του κυτταρικού κύκλου.Τα αποτελέσματά μας αναδεικνύουν την κλασπίνη σε χρήσιμο δείκτη πολλαπλασιασμού με χαρακτηριστική ειδικότητα για τη φάση S στους φυσιολογικούς και στους νεοπλασματικούς ιστούς.