Συχνότητα απομόνωσης του αναερόβιου μικροοργανισμού Clostridium perfringens από καλλιεργήσιμα εδάφη και συσχέτιση της παρουσίας του με άλλους μικροοργανισμούς και παράγοντες

Abstract

In the present study our interest was towards the isolation of Clostridium perfringens from cultivated soils bearing various crops. The possible correlations between the bacterium prevalence with the chemical characteristics of the soil samples (i.e. pH, electrical conductivity, Olsen phosphorus, available nitrogen, cation exchange capacity, organic content and total organic carbon) were also examined. For this purpose, 130 soil samples originating from 8 different cultivation areas in NE Greece were sampled and analyzed repeatedly in a period of two years. Analysis included, the isolation and identification of soil aerobic and anaerobic microflora through classical microbiological techniques and also the determination of soil’s key chemical characteristics. The soil microflora included Bacillus sp., E. coli and other Enterobacteriaceae, Gram (-) and (+) cocci, Lactobacillus sp., Streptococcus sp., Staphylococcus sp. and Neisseriaceae sp. The prevalence of C. perfringens was 38.5%, (25.4% as vegetative and 36.2% as spore forms). Considering the sampling areas, the spore forms were detected in seven and vegetative forms in 6 (out of 8 in total). In one area (Kastanies), no C. perfringens forms were detected. In general, spore forms were outnumbered in relation with vegetative ones in all but one area (Pirgos). Additionally in one area (Rizia) only spore forms were detected. The chemical analysis of the soil samples showed that the organic matter ranged from 0.38 to 2.47%, while the organic carbon (a fraction of the Total Organic Matter) between 0.22 and 1.44%. The available nitrogen was between 8.28 and 23.28 mg per kilogram of soil and Olsen phosphorus from 25.04 to 123.98 mg/Kg. Alkaline pH values were observed in the seven out of eight sampling areas while in one area (Kastanies) the pH was neutral and the electrical conductivity one of the lowest (0.08 dS/m). Exchange cations ranged from 213.73 - 576.5 for K+ and 39.89 - 68.03 mg/Kg for Na+. Differences in the frequencies of isolated C. perfringens along with the differences in soil chemical composition are indications of a variable and highly competitive microenvironment, which favors the germination (or sporulation) of the microbe. The type of the bearing crop, the availability of carbohydrates and other factors as the seasonality of cultivation, it also seems to influence the prevalence of this particular microorganism.

Στη παρούσα διατριβή το ενδιαφέρον μας στράφηκε στην απομόνωση του αναερόβιου μικροοργανισμού Clostridium perfringens από καλλιεργήσιμα εδάφη και έγινε προσπάθεια συσχέτισης της παρουσίας του με τις ιδιότητες των περιοχών δειγματοληψίας, ήτοι pH, ηλεκτρική αγωγιμότητα (E.C.), φώσφορος κατά Olshen, διαθέσιμο άζωτο, ανταλλάξιμο Na+ και Κ+, Οργανική Ουσία και Οργανικός άνθρακας, με σκοπό τη κατανόηση του ρόλου του μικροοργανισμού στο εδαφικό οικοσύστημα. Για τον σκοπό αυτό μελετήθηκαν 130 δείγματα εδάφους προερχόμενα από 8 περιοχές διαφορετικών καλλιεργειών επί 2 έτη. Η ανάλυση αφορούσε τη μικροβιολογική ποιότητα του εδάφους, η οποία εκάστοτε συσχετιζόταν με τις επικρατούσες χημικές παραμέτρους. Εφαρμόστηκαν κλασικές μικροβιολογικές μέθοδοι για την απομόνωση και ταυτοποίηση αερόβιων και αναερόβιων μικροοργανισμών. Τα αποτελέσματα έδειξαν απουσία του μικροοργανισμού σε 50 δείγματα (38,5%), παρουσία βλαστικών μορφών σε 33 δείγματα (25,4%) και παρουσία σπορογόνων μορφών σε 47 δείγματα (36,2%). Σπορογόνες μορφές ανιχνεύτηκαν σε 7 περιοχές δειγματοληψίας, ενώ βλαστικές μορφές σε 6 περιοχές. Σε μία μόνο περιοχή δεν ανιχνεύτηκαν μορφές του Clostridium perfringens (περιοχή Ζ -Καστανιές). Επικράτηση των σπορογόνων μορφών έναντι των βλαστικών μορφών υπήρχε σε όλες τις περιοχές δειγματοληψίας με εξαίρεση τη περιοχή Δ (Πύργος). Επιπλέον, στη περιοχή Η (Ρίζια) ανευρέθηκαν μόνο σπορογόνες μορφές του μικροοργανισμού. Παράλληλα σε όλες τις περιοχές απομονώθηκαν σπορογόνοι Bacillus sp. και είδη Enterobacteriaceae. Στη μικροβιακή χλωρίδα των περιοχών αποτυπώνονται σε διάφορα ποσοστά E. coli, Gram+κόκκοι και Lactobacillus sp,. Neisseriaceae sp., Streptococcus sp., Staphylococcus sp. και Gram-κόκκοι. Η οργανική ουσία και ο οργανικός άνθρακας κυμάνθηκαν από 0,38- 2,47% και 0,22% εώς 1,44%. Tα επίπεδα διαθέσιμου αζώτου από 8,28 mgΝΟ3-Ν/kg εδ. εώς 23,28 mgΝΟ3-Ν/kg και ο φώσφορος P κατά Olshen από 25,04mg/kg εδ. εώς 123,98 mg/kg. Επίσης, ελαφρά αλκαλικό pH καταγράφηκε στις 7 από τις 8 περιοχές. Στην περιοχή Ζ- Καστανιές καταγράφηκε ουδέτερο pH και η μικρότερη ηλεκτρική αγωγιμότητα 0,08 dS/m. Επιπλέον, τα ανταλλάξιμα ιόντα καλίου και νατρίου στις περιοχές δειγματοληψίας κυμάνθηκαν ως εξής: 213,73-573,50 ανταλλάξιμο Κ+ mg/Kg εδ. και 39,89-68,03 ανταλλάξιμο Na+ mg/Kg εδ. Συμπερασματικά, η οργανική ύλη που παραμένει στο έδαφος αποτελείται κατά κύριο λόγο από οργανικό άνθρακα και παρέχει ενέργεια και δομικά συστατικά για την ανάπτυξη και συντήρηση της εδαφικής μικροχλωρίδας. Η οργανική ουσία ως βασικό δομικό συστατικό στην ανάπτυξη των μικροοργανισμών, αποτελεί ταυτόχρονα την κυριότερη πηγή αζώτου, φωσφόρου, θείου και συντελεί στην διαφοροποίηση της μικροβιακής κοινότητας Επίσης τα υψηλά ποσοστά βλαστικών και σπορογόνων μορφών του Clostridium perfringens δείχνουν συγχρόνως και ένα ετεροτροφικό περιβάλλον για τον ίδιο τον οργανισμό (υψηλή οργανική ουσία και οργανικός άνθρακας) που οδηγεί σε ενδεχόμενη σπορογονία λόγω ανταγωνισμού με άλλους μικροοργανισμούς, την ίδια στιγμή που ο μικροοργανισμός διατηρεί και βλαστικές μορφές λόγω της θρεπτικής ενέργειας που αντλεί από την οργανική ουσία . Η συχνότητα εμφάνισης του αναερόβιου μικροοργανισμού τόσο σε σπορογόνες μορφές, όσο σε βλαστικές μορφές φαίνεται να επηρεάζεται από τις χημικές ιδιότητες του εδάφους. Οι καλλιεργητικές πρακτικές, οι επιπτώσεις τους στο έδαφος και η μικροχλωρίδα της καλλιέργειας διαμορφώνει ένα σύνθετο περιβάλλον ανάπτυξης του μικροοργανισμού. Το Clostridium perfringens σπορογονεί σε στρεσσογόνο περιβάλλον ή διατηρεί τις βλαστικές μορφές σε περίπτωση ενεργειακής διαθεσιμότητας στο έδαφος. Κάθε τύπος διαφορετικής καλλιέργειας φαίνεται να διαμορφώνει ένα ιδιαίτερο μικροπεριβάλλον. Η υψηλή συγκέντρωση σακχάρων, η επαφή με το έδαφος, τα υπέργεια ή τα υπόγεια στάδια ανάπτυξης του φυτού, οι θρεπτικές απαιτήσεις και οι εποχιακές συνθήκες ανάπτυξης διαμορφώνουν τους μικροβιακούς πληθυσμούς τους και συντελούν στην μικροβιακή βιοποικιλότητα του εδάφους.