Συμβολή στη μελέτη των ιστοπαθολογικών αλλοιώσεων του γεννητικού συστήματος του άρρενος και των μεταβολών των χαρακτηριστικών του σπέρματος στους επίμυες μετά από χορήγηση του αντινεοπλασματικού φαρμάκου Melphalan

Abstract

Melphalan is an alkylating chemotherapeutic agent currently used alone or in combination with other antiproliferative agents in the treatment of various neoplasms, such as multiple myeloma, leukaemia, lymphoma and neuroblastoma. Several lines of evidence suggest that chemotherapeutic regimens that include melphalan administration are related with impairment of testicular function. The aim of the present study was to assess the effect of melphalan treatment in the histology of rat testis and to combine these effects with changes that might be observed to the characteristics of rat spermatozoa. Also aim of this study was to assess the potential of reversibility of the above effects after 65 days from the discontinue of melphalan administration. For this purpose 60 adult (4 months old, 300 - 350 g) male Wistar rats were obtained from the approved investigative laboratory of the Theagenio Anticancer Hospital of Thessaloniki and housed four per cage under standard laboratory conditions. 30 of the rats were treated with melphalan, by intraperitoneal injection weekly, at a dose of 7,5 mg/kg body weight, for a period of three weeks. Melphalan (GlaxoSmithKline S.p.A., San Polo di Torrile, Parma, Italy, Trade name: Alkeran Inj.) was diluted with the accompanying diluent - solvent (60% v/v propylene glycol, sodium citrate, ethanol and water for injections) to a concentration of 5 mg/mL. Control animals (n=30) received only the diluent - solvent during the experiment. Animals were euthanized under ether anesthesia by exsanguination at different time-points including one (group M₁; n=15) and 65 (group M₆₅; n=15) days following last administration of melphalan. The dose and the times of sacrifice were selected, in order to establish a dose-response relationship, based on results of previous studies and the physiology of rat spermatogenesis. Two cross sections (4μm) were taken from the middle of Bouin fixed right testis and embedded in paraffin. The sections stained with periodic acid - Schiff reagent followed by a hematoxylin counterstain (PAS - H). Histopathological indices of testicular injury that examined were sloughing of seminiferous epithelium, vacuolization of Sertoli cells and seminiferous tubule, formation of multinucleated spermatids retention of spermatids at IX-XII stages, and seminiferous tubule atrophy. Germ cell apoptosis was also assessed semi-quantitatively by use of caspace-3 specific immunohistochemistry. Also the weight of pituitary gland, seminal vesicles, prostate gland, adrenal glands, kidneys, spleen, testicles and epididymis was recorded immediately after removal during the sacrifice. For the sperm evaluation purposes, the right epididymis was removed and weighted and its cauda was sliced into 7-8 pieces. After an incubation period of 1 hour into a modified Hank’s balanced solution, sperm evaluation was conducted by counting the number of spermatozoa per gr of epididymis and assessing their total motility (%) and progressive motility (%). Sperm morphology was also examined by randomly enumerating 200 spermatozoa, counterstained with eosin Y 5%, and the observed abnormalities were classified as head, neck, tail abnormalities and detached heads. After the statistical analysis of the organ weight measurements, the results showed that there was a significant irreversible decrease of testicles and prostate gland weight, irreversible increase of pituitary gland weight and reversible increase of spleen and adrenal glands weight. The weight of seminal glands, kidneys and epididymis was unaffected. According to the analysis of the results of histopathologic findings, there was clear evidence of a reversible increase of the sloughing of seminiferous epithelium, vacuolization of Sertoli cells and seminiferous tubule, formation of multinucleated spermatids, retention of spermatids at IX-XII stages, and apoptosis of germ cells due to the administration of melphalan. The proportion of atrophic seminiferous tubules was significantly elevated 65 days after the discontinue of melphalan administration. One fifth (20%) of the treated animals had advanced end-stage lesion characterized of generalized loss of germ cells (over 75% of their seminiferous tubules were atrophic). The above results show that melphalan is not only a germ cell toxicant but also affects Sertoli cell. Statistical analysis of the sperm evaluation results showed that melphalan administration causes an irreversible (at least for one spermatogenic cycle of 65 days) decrease of sperm number per gr of cauda epididymis, and a reversible decrease of sperm motion parameters that were assessed. Also the proportion of spermatozoa with morphologic abnormalities was increased at the 1st day after sacrifice but only the number of spermatozoa with head and neck abnormalities was restored 65 days after the cessation of melphalan administration. Taken together the results of the present study indicate that a powerful alkylating and mutagenic agent such as melphalan produced significant changes in the spermatogenic compartment of the rat testis. However, the damage was largely reversible, and the spermatogenic process was significantly restored within a two months period following termination of treatment.

Το melphalan είναι αλκυλιωτικός παράγοντας, που χορηγείται κυρίως σε περιπτώσεις κακοήθους μελανώματος, εντοπισμένων σαρκωμάτων των άκρων, πολλαπλού μυελώματος, καρκίνου ωοθηκών και νεανικού νευροβλαστώματος. Σύμφωνα με βιβλιογραφικά δεδομένα, το melphalan είναι από τα ελάχιστα φάρμακα, που έχει βρεθεί ότι μπορεί να επιδρά στα σπερματογόνα κύτταρα του όρχη. Όμως, οι επιδράσεις του στη σπερματογένεση δε φαίνεται να είναι τόσο δραματικές, αφού ασθενείς που τους χορηγήθηκε το melphalan κατάφεραν να τεκνοποιήσουν κανονικά, ενώ παρόμοιας χημικής δομής φάρμακα όπως η χλωραμβουκίλη, η βουσουλφάνη, η κυκλοφωσφαμίδη, προκαλούν σχεδόν μόνιμη στειρότητα. Η Ευρωπαϊκή Κοινότητα καθώς και άλλοι διεθνείς οργανισμοί (ICH, EPA) προτείνουν τη χρησιμοποίηση συγκεκριμένων πρωτοκόλλων για τη συνολική εκτίμηση της αναπαραγωγικής ικανότητας μετά από έκθεση σε διάφορες ουσίες. Τα πρωτόκολλα αυτά περιλαμβάνουν την ιστοπαθολογική εξέταση των αναπαραγωγικών οργάνων, επειδή θεωρείται ως ένας από τους πλέον ευαίσθητους και αξιόπιστους δείκτες, για την εκτίμηση της επίδρασης ουσιών στο αναπαραγωγικό σύστημα του άρρενος. Σκοπός της έρευνάς μας ήταν η μελέτη των ιστοπαθολογικών αλλοιώσεων που προκαλεί το melphalan στους όρχεις καθώς και στα υπόλοιπα όργανα που σχετίζονται με το αναπαραγωγικό σύστημα, η συσχέτιση των αλλοιώσεων αυτών με πιθανές μεταβολές των χαρακτηριστικών των σπερματοζωαρίων και η εξακρίβωση αν οι παραπάνω επιδράσεις του melphalan στους όρχεις και τα σπερματοζωάρια, είναι αναστρέψιμες. Για τις ανάγκες του πειραματισμού χρησιμοποιήθηκαν 60 επίμυες της φυλής Wistar που χωρίστηκαν σε δύο ομάδες. Στην ομάδα M₁ που αποτελούνταν από 15 πειραματόζωα το melphalan χορηγήθηκε στη δόση των 7,5 mg/kg σ.β. ενδοπεριτοναϊκά μία φορά την εβδομάδα για τρεις εβδομάδες και ακολούθησε η θυσία των ζώων αμέσως μετά την τελευταία χορήγηση του φαρμάκου. Στην ομάδα Μ₆₅ που επίσης αποτελούνταν από 15 πειραματόζωα, το melphalan χορηγήθηκε με τον ίδιο ακριβώς τρόπο, μόνο που η θυσία των ζώων έγινε 65 ημέρες μετά την τελευταία χορήγηση του φαρμάκου, προκειμένου να διαπιστωθεί εάν οι τυχόν αλλοιώσεις που προκάλεσε το melphalan μετά την χορήγησή του, αποκαταστάθηκαν με την πάροδο του χρόνου και σε ποιο βαθμό. Χρησιμοποιήθηκαν και δύο ομάδες μαρτύρων (C₁ και C₆₅) των 15 ζώων η κάθε μια που θυσιάστηκαν αντίστοιχα με τις δύο προαναφερόμενες ομάδες πειραματοζώων. Κατά τη θυσία αφαιρέθηκαν και ζυγίστηκαν οι όρχεις, οι επιδιδυμίδες οι κυστεοειδείς αδένες, ο προστάτης αδένας, τα επινεφρίδια, ο σπλήνας και η υπόφυση και κατόπιν μονιμοποιήθηκαν προκειμένου να ακολουθήσει η ιστολογική τους εξέταση. Επίσης κατά τη θυσία λήφθηκαν σπερματοζωάρια από την επιδιδυμίδα και έγινε αξιολόγηση των χαρακτηριστικών τους. Από την στατιστική επεξεργασία και την αξιολόγηση των αποτελεσμάτων προέκυψαν οι εξής διαπιστώσεις. 1. Το melphalan προκαλεί μη αναστρέψιμη μείωση του βάρους των όρχεων και του προστάτη αδένα, μη αναστρέψιμη αύξηση του βάρους της υπόφυσης, αναστρέψιμη μείωση του βάρους του σπλήνα και αναστρέψιμη αύξηση του βάρους των επινεφριδίων. Δεν επηρεάζει σημαντικά τα βάρη των κυστεοειδών αδένων και των επιδιδυμίδων. 2. Το melphalan προκάλεσε την σημαντική απόπτωση των κυττάρων της σπερματικής σειράς του επιθηλίου των σπερματικών σωληναρίων, την αποφολίδωση του σπερματικού επιθηλίου στον αυλό του σωληναρίου, την εμφάνιση κενοτοπίων μέσα και γύρω από τα κύτταρα του Sertoli, την εμφάνιση πολυπύρηνων σπερματίδων, και την κατακράτηση κεφαλών σπερματίδων στη βάση του επιθηλίου των σπερματικών σωληναρίων. Όλες οι παραπάνω αλλοιώσεις αποκαθίσταντο όταν μεσολαβούσε χρόνος 65 ημερών από την τελευταία χορήγηση του melphalan. Επίσης σε ποσοστό 20% των ζώων, το melphalan προκάλεσε την πλήρη ατροφία των σπερματικών σωληναρίων του όρχη, αλλοίωση που είναι μη αναστρέψιμη. 3. Το melphalan μετά τη χορήγηση του, προκάλεσε την μείωση του ποσοστού των σπερματοζωαρίων με προωθητική κίνηση και την εμφάνιση ανωμαλιών της μορφολογίας των σπερματοζωαρίων που σχετίζονταν με την περιοχή της κεφαλής και του αυχένα. Oι παραπάνω μεταβολές αποκαταστάθηκαν μετά την πάροδο 65 ημερών από την τελευταία χορήγηση του φαρμάκου. Το melphalan προκάλεσε επίσης την μείωση της πυκνότητας του σπέρματος, την εμφάνιση αποκομμένων κεφαλών καθώς και μορφολογικές ανωμαλίες των σπερματοζωαρίων που εντοπίζονταν στην περιοχή της ουράς τους. Οι παραπάνω αλλοιώσεις ήταν μη αναστρέψιμες. Τέλος το melphalan δεν επηρέασε σημαντικά την κινητικότητα των σπερματοζωαρίων. Συνοψίζοντας, συμπεραίνουμε ότι οι αλλοιώσεις που προκάλεσε το melphalan με τη χορήγησή του, ήταν ιδιαίτερα σημαντικές. Ωστόσο η επίδραση του φαρμάκου στο αναπαραγωγικό σύστημα του άρρενος επίμυος ήταν τελικά σε μεγάλο βαθμό αναστρέψιμη.