Γονοτυπικός προσδιορισμός ειδών και υποειδών του παρασίτου Leishmania

Abstract

Είδη που ανήκουν στο σύμπλεγμα L. donovani (L. infantum, L. donovani, και L. archibaldi) είναι υπεύθυνα για την σοβαρότερη μορφή λεϊσμανίασης, την σπλαχνική λεϊσμανίαση (VL). Τα είδη αυτά σχετίζονται με διαφορετικά επιδημιολογικά/κλινικά χαρακτηριστικά και η ταξινόμηση τους βασίζεται στην τεχνική της πολυεστιακής ισοενζυμικής ηλεκτροφόρησης (MLEE). Η ταξινόμηση του συμπλέγματος L. donovani έχει αμφισβητηθεί σε διάφορες πρόσφατες μοριακές μελέτες και έχει γίνει εμφανής η ανάγκη αναθεώρησής της (κεφάλαιο 1.2.6, σελ. 13). Ένα επιπλέον πρόβλημα είναι ότι η μέθοδος MLEE έχει περιορισμένη διακριτική ικανότητα, με αποτέλεσμα να μην μπορεί να διαφοροποιήσει περαιτέρω τα στελέχη ΜΟΝ-1. Η αδυναμία της μεθόδου ΜLEE, σε συνδυασμό με την κυριαρχία των παρασίτων MON-1 στην περιοχή της Μεσογείου, καθιστά μια ευρείας κλίμακας πληθυσμιακή μελέτη στην περιοχή αυτή ιδιαίτερα δύσκολη (κεφάλαιο 1.4.3, σελ. 13). Επίσης, η μέθοδος MLEE είναι επίπονη και χρονοβόρα, ενώ η επιτυχία της βασίζεται στην εκ των προτέρων απομόνωση του παρασίτου. Η καλλιέργεια του παρασίτου in vitro εξαρτάται με την σειρά της από την διαφοροποίηση του παρασίτου από αμαστιγωτό σε προμαστιγωτό καθώς και από την ικανότητα ανάπτυξης του στο υλικό καλλιέργειας, με κίνδυνο βακτηριακής ή μυκητιακής μόλυνσής της. Είναι λοιπόν επιτακτική η ανάγκη ανάπτυξης νέων DNA μοριακών εργαλείων τυποποίησης των διαφόρων ειδών και/ή ζυμοδεμάτων του συμπλέγματος L. donovani. Στόχοι της παρούσας διατριβής είναι: α) η ανάπτυξη νέων δεικτών που θα επιτρέψουν την καλύτερη ταξινόμηση παρασίτων του συμπλέγματος L. donovani, με βάση τις γονοτυπικές τους διαφορές, β) η μελέτη της πληθυσμιακής δομής των Μεσογειακών στελεχών L. infantum, με έμφαση στο ζυμόδεμα ΜΟΝ-1 και γ) η ανάπτυξη αξιόπιστων, γρήγορων και απλών μοριακών τεχνικών τυποποίησης, που θα έχουν την δυνατότητα να χρησιμοποιηθούν απευθείας σε κλινικά δείγματα. Για την ανάπτυξη των δεικτών, χρησιμοποιείται ένας ικανός αριθμός στελεχών (25) που ανήκουν σε διάφορα υποείδη του συμπλέγματος L. donovani και παρουσιάζουν ενδιαφέρον (διαφορετική γεωγραφική κατανομή, κλινική εικόνα και διαφορετική ταξινόμηση τους σύμφωνα με την μέθοδο MLEE). Ειδικότερα επιλέγονται προς μελέτη κωδικές περιοχές γονιδίων κυτταρικής οικονομίας (housekeeping genes) και αντιγόνων καθώς και μη μεταφραζόμενες περιοχές. Για την μελέτη της πληθυσμιακής δομής των Μεσογειακών στελεχών L. infantum, θα γίνει αρχικά επιλογή της καλύτερης μεθόδου τυποποίησης και στην συνέχεια θα γίνει η τυποποίηση αντιπροσωπευτικής ομάδας στελεχών. Τα Ελληνικά στελέχη που θα συμπεριληφθούν στην μελέτη αυτή θα απομονωθούν από την επίκουρο καθηγήτρια του Πανεπιστημίου της Κρήτης Μ. Αντωνίου (στελέχη από ανθρώπους και σκύλους με VL από Αθήνα και Κρήτη). Τα αποτελέσματα που θα προκύψουν θα συμβάλουν στην διαλεύκανση πολλών αναπάντητων ερωτημάτων που αφορούν το παράσιτο, όπως: α) το ποσοστό της γενετικής απομόνωσης και της γονιδιακής ροής μεταξύ γεωγραφικών πληθυσμών του παρασίτου, β) το ρόλο του ξενιστή-δεξαμενή και του ενδιάμεσου ξενιστή στην μετάδοση και διατήρηση του γενετικού πολυμορφισμού γ) την διερεύνηση της πιθανότητας ύπαρξης μεγαλύτερης γενετικής ετερογένειας σε ασθενείς με AIDS σε σχέση με άτομα μη μολυσμένα με HIV.