Μοριακή δομή και έκφραση αυτοαντιγόνων στα συστηματικά αυτοάνοσα νοσήματα

Abstract

Aim of this study was to examine tissue distribution and functional expression of Toll-like receptors (TLR) and heat-shock protein receptor CD91, as well as TLR ligand dependent effect in La/SSB autoantigen subcellular redistribution in minor salivary gland (MSG) biopsy tissues and non-neoplastic salivary gland epithelial cell (SGECs) cultures obtained from patients diagnosed with Sjögren’s syndrome (SS) and disease controls. At transcriptional level, expression of CD91 and TLR-9 receptors by SGECs was revealed by means of reverse transcriptase polymerase chain reaction (PCR), while quantitive PCR analysis showed significantly higher constitutive mRNA expression levels of TLR -1, -2, -3 and -4 molecules in SS epithelial cells was confirmed by flow cytometry, while cell stimulation with TLR -2, -3 and -4 ligands resulted in up-regulation of CD54/ICAM.1, CD40 and MHC-I protein expression. Moreover, immunohistochemical and immunocytochemical analysis of CD91, TLR-9 receptors and La/SSB autoantigen in MSG biopsy tissues and SGECs obtained from patients diagnosed with Sjögren’s Syndrome and disease controls displayed receptor cytoplasmic expression by ductal epithelial cells from both patients and controls, and by lymphocytic infiltration cells in SS tissues, whereas La/SSB autoantigen exhibited mainly nuclear localization in SGECs, findings further confirmed by flow cytometric analysis. Functional studies showed specific and competitive binding of alpha2-macroglobulin, a well-recognized CD91 ligand, following endocytosis by live cells. In parallel, immunocytochemical study of TLR-9 receptor and La/SSB autoantigen, before or after treatment with TLR-9 ligands, along with IL-8 expression levels measured at cell culture supernatants, revealed both functional expression of these receptors and association of intracellular signaling pathways with cellular activation mechanisms, as determined by La/SSB autoantigen translocation from nucleus to cytoplasma, upon TLR stimulation. In conclusion, the association of autoantigens and innate immune receptors functional expression in the immunopathologic lesion of Sjögren’s Syndrome plays a central role both in innate immune response regulation and the perpetuation of inflammatory reactions.

Σκοπός της παρούσας διατριβής είναι η μελέτη της ιστικής κατανομής και της λειτουργικής έκφρασης των υποδοχέων Toll-like (TLRs) και του υποδοχέα πρωτεϊνών θερμικού στρες CD91, καθώς και η εξαρτώμενη από προσδέτες των TLRs επίδραση στην κυτταρική ανακατανομή του αυτοαντιγόνου La/SSB σε βιοπτικό υλικό επικουρικών σιελογόνων αδένων χείλους και καλλιεργημένων μη νεοπλαστικών επιθηλιακών κυτταρικών σειρών (ΕΚΣΑ), ασθενών με Σύνδρομο Sjögren (ΣΣ) και μαρτύρων. Σε μεταγραφικό επίπεδο, με απλή αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) αντίστροφης μεταγραφής διαπιστώθηκε η έκφραση των υποδοχέων CD91 και TLR-9, σε καλλιεργημένα κύτταρα, ενώ μέσω ποσοτικής PCR, ανιχνεύθηκαν σημαντικά υψηλότερα ποσοστά mRNA των μορίων των TLR-1, -2, -3 και -4 σε ΕΚΣΑ ασθενών με ΣΣ σε σχέση με εκείνα των μαρτύρων. Με κυτταρομετρία ροής επιβεβαιώθηκαν τα υψηλά επίπεδα πρωτεϊνικής έκφρασης των μορίων των TLR -2, -3 και -4 σε καλλιεργημένες σειρές, ενώ η επίδραση χημικά συντεθειμένων προσδετών για τον κάθε υποδοχέα οδήγησε στην αύξηση των επιπέδων έκφρασης των ανοσοδραστικών μορίων CD54/ICAM.1, CD40 και MHC-I. Επιπλέον, από την ανοσοϊστοχημική και ανοσοκυτταροχημική των υποδοχέων CD91, TLR-9 και του αυτοαντιγόνου La/SSB σε βιοψίες και κύτταρα ασθενών με ΣΣ και μαρτύρων, διαπιστώθηκε η κυτταροπλασματική εντόπιση των υποδοχέων στα πορικά επιθηλιακά κύτταρα, ευρήματα που επιβεβαιώθηκαν και με κυτταρομετρική ανάλυση. Σε λειτουργικές μελέτες, αναγνωρίστηκε η ειδική και συναγωνιστική δέσμευση της α2 μακροσφαιρίνης, αναγνωρισμένου προσδέτη για το CD91 και η επακόλουθη ενδοκυττάρωσή του από ζωντανά κύτταρα. Συγχρόνως, η ανοσοκυτταροχημική μελέτη των υποδοχέων TLR-9 και του αυτοαντιγόνου La/SSB, πριν και μετά την επίδραση διαφόρων συγκεντρώσεων χημικά συντεθειμένων αγωνιστών τους, καθώς και η μέτρηση των επιπέδων έκφρασης της IL-8 φανέρωσε τόσο την λειτουργική έκφραση των υποδοχέων, όσο και την αλληλεπίδραση των ενδογενών μονοπατιών ενεργοποίησης των υποδοχέων με τους μηχανισμούς κυτταρικής ενεργοποίησης, όπως διαπιστώνεται από την ανακατανομή του αυτοαντιγόνου La/SSB. Συμπερασματικά, η αλληλεπίδραση της λειτουργικής έκφρασης αυτοαντιγόνων και υποδοχέων φυσικής ανοσίας στην ανοσοπαθολογική βλάβη του Συνδρόμου Sjögren αποκτά ξεχωριστή σημασία για την ρύθμιση των αποκρίσεων της φυσικής ανοσίας και τη διαιώνιση των φλεγμονωδών αντιδράσεων.