Αλκοολικές δεϋδρογονάσες (Οξειδάσες) του βακτηρίου Methylobacterium extorquens και της φράουλας Fragaria x ananassa (cv Elsanta): απομόνωση, μελέτη, έκφραση και σύγκρισή τους

Abstract

The individual, as well as the combinational activity of alcohol dehydrogenases (ADH) - from bacterium Methylobacterium extorquens (with CABI number of registration IMI369321) and from strawberry Fragaria x ananassa cv. Elsanta - were studied in this work. Additionally there was a study of the production of furaneol (2,5-dimethyl-4-hydroxy-2H-furan-3-one or DMHF) by these enzyme sources, from various substrates. The optimal pH of the enzyme action was found to be pH 6,0 for the bacterium while for the seeds of strawberry was pH 10,0 respectively. In cell free extracts of M. extorquens - an organism capable of growing in 1,2-propanediol as source of energy and carbon - high activities of NAD-dependent ADH were found with 1,2-propanediol and methanol as substrates. The best substrates for the ADH from the body of strawberry were 1-propanol and ethanol. Respectively the best substrates for ADH from the seeds of strawberry (for pH 6,0) were ethanol and methanol. Similarly the best substrates for the ADH from the seeds of strawberry (for pH 10,0) were found to be ethanol and methanol. No important ADH activity was observed for aldehydes with the 2 enzymes of strawberry, while important activity was observed for the ADH from the bacterium. From the presented elements it is obvious that certain heavy metals (Pb, Cr, Ba), as well as the use of EDTA and NaN3 decrease the enzyme activity, for both the bacterium and the strawberry. Apart from the comparisons for the substrate, the ADH from the bacterium was cleaned 2,8 times while ADH from strawberry was cleaned 2,3 times respectively. The corresponding size of cleaning for the enzyme of the seeds of was 2,5. ADH enzyme activity was also observed after native electrophoresis and the export of protein zones. It is also reported here that the molecular weight of enzyme from the seeds of strawberry is 47,0 kDa while from the body of strawberry is 24,6 kDa. Respectively for the Methylobacterium extorquens the molecular weight is 45,1 kDa similar enough with the one from the seeds of strawberry. The results from the HPLC analysis showed that the best precursor molecules for the production of DMHF in the combined mixture [bacterium & body of strawberry ], comparatively with the enzyme extract of the body of strawberry, were found to be 1-propanol, 1,2-propanediol, fructose, glucose and mannitol. The best precursor molecules for the production of DMHF in the combined mix [bacterium & seeds of strawberry] - comparatively with the enzyme extract of the seeds of strawberry, were found to be 1-propanol, ramnose , sucrose, fructose and glucose Moreover a comparison of the oxidative capacities of the corresponding enzymes (ADH) regarding the bacterium and the strawberry revealed that the combination of their activities produced higher activity from the theoretical sum from their individual one. All of the above leads us to the conclusion that the combined mixture of the enzymes from the three different sources reacts at a higher percentage when they are present all together and thus strengthens the metabolic pathway for synthesizing odour compounds such as DMHF. In addition ADHs from the bacterium and the strawberry tend to have more efficient collaboration when these two are simultaneously present. The same conclusion is in effect for the ADH from the seeds from strawberries and the strawberry. On the other hand the collaboration of ADH from the bacterium and the seeds from strawberries is lessened when the two sources of enzymes are present together. With regard to the thermodynamic results that are derived from Arrhenius equation having 1,2-propanediol - as substrate for the enzyme - the following results were obtained. The activation energy (Ea) of the enzyme from the seeds of strawberry corresponds to the 85% of the activation energy of the corresponding enzyme from the strawberry while the corresponding Ea of the enzyme from the Methylobacterium extorquens is roughly the same with the enzyme from the strawberry. Moreover the change of enthalpy (ΔH) for the enzyme from the seeds of strawberry corresponds to the 84% of ΔH the corresponding enzyme from the strawberry while the corresponding ΔH of the enzyme from Methylobacterium extorquens is roughly the same with the ΔH of the enzyme from strawberry. Respectively the change of free energy (ΔG) for the enzyme from the seeds of strawberry corresponds to 87 % of the corresponding enzyme from the strawberry while the corresponding ΔG of the enzyme from Methylobacterium extorquens is roughly the same with the ΔG of the enzyme from strawberry.

Σε αυτή την εργασία μελετήθηκε η μεμονωμένη, καθώς και η συνδυαστική δράση των αλκοολικών δεϋδρογονασών [ADH] από το βακτήριο Methylobacterium extorquens (με αριθμό μητρώου CABI IMI369321) και από την φράουλα Fragaria x ananassa cv. Elsanta. Πραγματοποιήθηκε επίσης η μελέτη της παραγωγής φουρανεόλης (ΔΜΥΦ) από αυτές τις πηγές ενζύμων. Το βέλτιστο pH δράσης του ενζύμου για το βακτήριο ήταν το pH 6,0, ενώ αντίστοιχα για τα σπόρια της φράουλας ήταν το pH 10,0. Σε ενζυμικό εκχύλισμα του Μ. extorquens - ενός οργανισμού ικανού να αναπτυχθεί σε 1,2-προπανοδιόλη ως πηγή ενέργειας και άνθρακα - οι υψηλότερες δραστικότητες NAD-εξαρτωμένων ADH βρέθηκαν να είναι με την 1,2-προπανοδιόλη και τη μεθανόλη ως υποστρώματα. Τα καλύτερα υποστρώματα για την ADH από το σώμα της φράουλας ήταν η 1-προπανόλη και η αιθανόλη. Αντίστοιχα τα καλύτερα υποστρώματα για την ADH από τα σπόρια της φράουλας (για το pH 6,0) ήταν η αιθανόλη και η μεθανόλη. Ομοίως τα καλύτερα υποστρώματα για την ADH από τα σπόρια της φράουλας (για το pH 10,0) ήταν η αιθανόλη και η μεθανόλη. Καμία σημαντική ADH δραστικότητα δεν παρατηρήθηκε για διάφορες αλδεΰδες σαν υποστρώματα με τα 2 ένζυμα της φράουλας, ενώ υπήρξε σημαντική δραστικότητα για την ADH από το βακτήριο. Από τα παρουσιαζόμενα στοιχεία είναι προφανές ότι ορισμένα βαρέα μέταλλα (Pb, Cr, Ba) , καθώς και το EDTA όπως και το NaN3 μειώνουν την ενζυμική δραστικότητα και για το βακτήριο και για τη φράουλα. Εκτός από τις συγκρίσεις για το υπόστρωμα, η ADH από το βακτήριο καθαρίστηκε 2,8 φορές, ενώ η ADH από τη φράουλα καθαρίστηκε 2,3 φορές. Το αντίστοιχο μέγεθος καθαρισμού για το ένζυμο από τα σπόρια ήταν 2,5 φορές. Η ενζυμική δραστικότητα της ADH παρατηρήθηκε επίσης μετά από την μη αποδιατακτική (native) ηλεκτροφόρηση και την εξαγωγή των πρωτεϊνικών ζωνών. Αναφέρεται εδώ επίσης το γεγονός ότι το μοριακό βάρος του ενζύμου από τα σπόρια της φράουλας είναι 47,0 kDa ενώ από το σώμα της φράουλας 24,6 kDa. Αντίστοιχα για το Methylobacterium extorquens το μοριακό Βάρος του είναι 45,1 kDa αρκετά παραπλήσιο δηλαδή με αυτό από τα σπόρια της φράουλας. Τα αποτελέσματα από την HPLC ανάλυση έδειξαν ότι τα καλύτερα πρόδρομα μόρια γα την παραγωγή ΔΜΥΦ στο συνδυασμένο μίγμα [βακτήριο & σώμα φράουλας], συγκριτικά με το ενζυμικό εκχύλισμα του σώματος της φράουλας, βρέθηκαν να είναι η 1-προπανόλη, η 1,2-προπανοδιόλη, η φρουκτόζη, η γλυκόζη και η μαννιτόλη. Τα καλύτερα πρόδρομα μόρια για την παραγωγή ΔΜΥΦ στο συνδυασμένο μίγμα [βακτήριο & σπόρια φράουλας], συγκριτικά με το ενζυμικό εκχύλισμα των σπορίων της φράουλας, βρέθηκαν να είναι η 1-προπανόλη, η ραμνόζη, η σακχαρόζη, η φρουκτόζη και η γλυκόζη. Επιπλέον μια σύγκριση των οξειδωτικών ικανοτήτων των αντίστοιχων ενζύμων (ADH) σχετικά με το βακτήριο και τη φράουλα αποκάλυψε ότι ο συνδυασμός της οξειδωτικής δραστικότητας τους παρήγαγε μια υψηλότερη δραστικότητα από το θεωρητικό άθροισμα τους. Όλα τα ανωτέρω μας οδηγούν στο συμπέρασμα ότι το συνδυασμένο μείγμα του ενζύμου από τις τρεις διαφορετικές πηγές, αντιδρά σε ένα υψηλότερο ποσοστό όταν είναι παρούσες όλες μαζί και έτσι ενισχύουν το μεταβολικό μονοπάτι για το σχηματισμό των ενώσεων του αρώματος, όπως η ΔΜΥΦ. Επιπλέον οι ADH από το βακτήριο και τη φράουλα τείνουν να έχουν πιο αποδοτική συνεργασία όταν αυτές είναι συγχρόνως παρούσες. Το ίδιο συμπέρασμα ισχύει για την ADH από τα σπόρια από φράουλες και το σώμα της φράουλας. Αφ' ετέρου η συνεργασία των ADH από το βακτήριο και τα σπόρια από φράουλες αποδυναμώνεται όταν οι δύο πηγές ενζύμων είναι παρούσες από κοινού. Σχετικά με τα θερμοδυναμικά αποτελέσματα που προκύπτουν από την εξίσωση Arrhenius - έχοντας σαν υπόστρωμα στο ένζυμο την 1,2-προπανοδιόλη - προκύπτουν τα εξής.