Η επίδραση της βαθειάς υποθερμίας στην εγκεφαλική προστασία: ιστολογική μελέτη σε οξύ πειραματικό μοντέλο σε χοίρους

Abstract

Although profound hypothermic circulatory arrest (HCA) is a well-established method for use in surgery for a variety of cardiovascular abnormalities and mainly aortic arch surgery, brain damage as a consequence of HCA remains a frequent if often subtle complication. The optimal conditions for maximizing cerebral protection during HCA are not well established. There is still controversy about basic aspects of implementing HCA such as the best temperature at which to arrest circulation. Experimental studies have demonstrated that prolonged HCA can lead to neuronal cell injury or death, probably as a consequence of a number of different pathways triggered by ischemia. Several studies have shown that either focal or global cerebral ischemia can lead to neuronal injury by apoptosis, as well as by necrosis. The original purpose of this study is to compare the results using truly profound hypothermia with those obtained with profound hypothermic conditions and to assess whether cooling to 10°C can reduce neurological injury during 75 minutes of HCA in an acute porcine model compared to less profoundly cooled (18°C) animals. Sixteen pigs were divided into three groups. Group A (n=6) received hypothermic circulatory arrest at 18°C for 75 min, Group B (n= 6) hypothermic circulatory arrest at 10°C for 75 min and Group C (n=4) served as normal controls. After gradual rewarming and 80 minutes of reperfusion, treatment animals were sacrificed and brains were perfusion-fixed and cryopreserved. Brain regions evaluated included the precentral gyrus (motor neocortex), the postcentral gyrus (sensory neocortex), hippocampus, cerebellum, thalamus and anterior ventral medulla. Regional patterns of neuronal apoptosis after hypothermic circulatory arrest was characterized by in situ DNA fragmentation using TUNEL histochemistry. Hematoxylin and eosin histology was used to characterize cell damage morphologically. TUNEL-positive cells were scored on a scale of 0 to 5. Grade 0: no TUNEL-positive cells; Grade 1: <10%; Grade 2: 10-25%, Grade 3: 25-50%, Grade 4: 50-75%; and Grade 5: >75%. None of the treatment animals undergoing HCA or controls in this acute protocol demonstrated histologic evidence of neuronal injury in any of the brain regions assessed using hematoxylin and eosin staining. Hypothermic circulatory arrest for 75 minutes at 18°C resulted in significantly higher TUNEL positive scores compared to normal controls in all brain regions examined. Significantly higher concentration of TUNEL (+) cells were observed in the sensory cortex, motor cortex and hippocampus, compared to the cerebellum, thalamus and medulla (p ≤ 0.05; ANOVA followed by Fischer PLSD). HCA for 75 minutes at 10°C also resulted in significantly higher TUNEL (+) scores compared to normal controls in all brain regions assessed, although scores were generally lower than those observed at 18°C HCA. In contrast with our findings at 18°C, animals treated with 75 min of HCA at 10°C showed no differences in tissue specific vulnerabilities among the neural regions assessed. The mean number of TUNEL (+) cells in serial sections from the sensory cortex, motor cortex and hippocampus showed a significant reduction when cooled to 10°C as compared to 18°C (t-test p ≤ 0.006, p ≤ 0.0001 and p ≤ 0.006, respectively). This data support that cerebral protection may be better at very cold temperatures compared to 18°C hypothermia. Regions selectively vulnerable to neuronal injury, as the neocortex and hippocampus, are offered more neural protection by profound hypothermia. These affects are observed in the acute state, suggesting activation of the apoptotic mechanisms at early stages can be inhibited by profound hypothermia.

Παρά το γεγονός ότι η υποθερμική ολική κυκλοφορική παύση (ΥΟΚΠ) είναι μία γνωστή μέθοδος που χρησιμοποιείται σε μία πλειάδα καρδιοχειρουργικών επεμβάσεων και κυρίως στις επεμβάσεις στο αορτικό τόξο και διορθώσεων συγγενών καρδιαγγειακών ανωμαλιών, η εγκεφαλική βλάβη σαν συνέπεια της ΥΟΚΠ παραμένει συχνή και δύσκολα αντιμετωπίσιμη. Οι ιδανικές συνθήκες για την μεγιστοποίηση της εγκεφαλικής προστασίας κατά την διάρκεια της ΥΟΚΠ δεν έχουν ερευνηθεί πλήρως. Υπάρχει αντιπαράθεση απόψεων πάνω σε βασικά θέματα που αφορούν την ΥΟΚΠ, όπως στην καλύτερη θερμοκρασία κατά την οποία γίνεται η παύση της κυκλοφορίας. Ο στόχος αυτής της μελέτης είναι να συγκρίνει τα αποτελέσματα, όσο αφορά την εγκεφαλική βλάβη, που προκύπτουν από την εισαγωγή της ΟΚΠ σε δύο διαφορετικές θερμοκρασίες (βαθειά υποθερμία και πολύ βαθειά υποθερμία). Στη μελέτη μας χρησιμοποιήσαμε δεκαέξι άρρενες χοίρους βάρους 25-30 κιλών ηλικίας 3 μηνών, οι οποίοι ήταν νευρολογικά ώριμοι. Τα πειραματόζωα χωρίστηκαν σε τρεις ομάδες. Στην ομάδα A (n=6) έγινε ΥΟΚΠ στους 18°C για 75 λεπτά, στην ομάδα Β (n=6) έγινε ΥΟΚΠ στους 10°C για 75 λεπτά και η ομάδα Γ (n=4) ήταν η ομάδα ελέγχου με τα φυσιολογικά ζώα. Μετά από την εφαρμογή της διαδικασίας (εξωσωματική κυκλοφορία, υποθερμία στους 10°C ή 18°C ανάλογα, ολική κυκλοφορική παύση για 75 min και επαναθέρμανση για 80 περίπου λεπτά) το ζώο θανατωνόταν και μονιμοποιούνταν και λαμβάνονταν ο εγκέφαλος. Οι υπό μελέτη περιοχές ήταν: 1. κινητικός φλοιός, 2. αισθητικός φλοιός, 3. θάλαμος, 4. παρεγκεφαλίδα 5. προμήκης και 6. ιππόκαμπος. Τομές από τις παραπάνω περιοχές υποβάλλονταν σε χρώση Αιματοξυλίνης-Ηωσίνης για την μορφολογική εκτίμηση της βλάβης και στην μέθοδο TUNEL (από τα αρχικά των λέξεων TdT-mediated dUTP nick end-labelling assay, που είναι μία μέθοδος με την οποία εκτιμάται ο in situ κερματισμός του DNA που λαμβάνει χώρα κατά τη διαδικασία της απόπτωσης) για την εκτίμηση της απόπτωσης. Σε καμία από τις πειραματικές ομάδες ΥΟΚΠ και στην ομάδα ελέγχου δεν παρατηρήθηκαν ιστολογικά και μορφολογικά χαρακτηριστικά νευρωνικής βλάβης με την χρήση της χρώσης Αιματοξυλίνης-Ηωσίνης. Όλοι οι εγκεφαλικοί ιστοί με την επεξεργασία με την μέθοδο TUNEL για τον έλεγχο της κατάτμησης του DNA, παρουσίασαν TUNEL (+) σκορ σε διαφορετικό βαθμό, ενώ στην περίπτωση της ομάδας ελέγχου τα σκορ ήταν πολύ χαμηλά. Η ΥΟΚΠ στους 18°C και στους 10°C είχε ως αποτέλεσμα σημαντικά αυξημένα TUNEL (+) σκορ σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου σε όλες τις εγκεφαλικές περιοχές. Στην ομάδα ΥΟΚΠ στους 18°C παρατηρήθηκε ότι συνολικά αυξημένη TUNEL (+) αντίδραση υπήρχε στον νεοφλοιό και τον ιππόκαμπο σε σύγκριση με τον προμήκη, την παρεγκεφαλίδα και τον θάλαμο (p ≤ 0.05; ANOVA και Fischer PLSD), ενώ στους 10°C δεν παρουσίασαν, μεταξύ τους, στατιστικά σημαντική διαφορά στην κατά περιοχές νευρωνική ευαισθησία. Αντίθετα, αρκετά ενδιαφέροντα ήταν τα ευρήματά μας, όσο αφορά την σύγκριση των δύο ομάδων ΥΟΚΠ μεταξύ τους. Συγκεκριμένα, όπως αποδείχτηκε με την χρήση του t-test, ο νεοφλοιός, κινητικός και αισθητικός, και ο ιππόκαμπος παρουσίασαν σημαντικά χαμηλότερα TUNEL (+) σκορ στην ομάδα της πολύ βαθειάς ΥΟΚΠ στους 10°C σε σύγκριση με την βαθειά ΥΟΚΠ στους 18°C (p ≤ 0.006, p ≤ 0.0001 και p ≤ 0.006, αντίστοιχα). Φαίνεται λοιπόν, ότι η χαμηλότερη θερμοκρασία κατά τη διάρκεια παρατεταμένης υποθερμικής ολικής κυκλοφορικής παύσης είναι περισσότερο νευροπροστατευτική γιατί διαπιστώθηκαν λιγότερες ενδείξεις απόπτωσης στις ευπρόσβλητες περιοχές του εγκεφάλου. Αυτή η ευεργετική επίδραση της βαθειάς υποθερμίας παρατηρείται σε αυτό το οξύ πειραματικό μοντέλο, υποδηλώνοντας ότι η ενεργοποίηση του αποπτωτικού μηχανισμού γίνεται από το αρχικό κιόλας στάδιο και προλαμβάνεται από την περαιτέρω μείωση της θερμοκρασίας.