Διερεύνηση του ρόλου πρωτεϊνών µε ικανότητα πρόσδεσης hnRNA και mRNA στην επαγωγή, εξέλιξη και καθιέρωση του καρκίνου του πνεύµονα σε πειραµατικά πρότυπα καρκινογένεσης

Abstract

The present dissertation refers to the involvement of RNA binding proteins (RBPs) in the induction and establishment of lung cancer in cellular and animal experimental models. The study has focused on the specific role of the heterogeneous nuclear ribonucleoproteins family (hnRNP), with major emphasis in hnRNPs A/B type (hnRNP A1, A2/B1, A3), stable components of hnRNP and mRNP complexes. which participate in almost all cellular processes related to the biogenesis of mRNA. In parallel, the expression pattern of other RBP proteins was studied, with emphasis in HuR protein that has a major role in the stability/translation of mRNA targets. Since the biological significance of the involvment of hnRNP (mainly A2/B1) and HuR proteins in the human lung cancer is almost established, we studied experimental mouse models of chemically induced lung cancer. Overall, three different mouse strains and two schemes of chemical lung cancer induction [urethane and aromatic polycyclic hydrocarbons (PAH)] were applied. Immunochemical detection of the expression levels of RBP proteins was performed in total extracts prepared from lung tissue as well as histological/immunohistochemical analysis. The results from the three experimental mouse models are compatible with the absence of a detectable increase in the levels of the proteins tested in lung cancer tissue compared to normal tissue samples. These findings in principle agree with current data reported by Peebles KA et al (2007), showing changes in the levels of hnRNP A2/B1. Therefore, the results obtained from the application of experimental mouse models are in obvious disagreement with those from human lung cancer biopsies, where overexpression of hnRNP A/B and HuR occurs in high proportion as compared to the adjacent normal tissue. Therefore, it is recommended that these results should be taken into consideration before applying outcome animal models in the human lung cancer. Based on the common characteristics that hnRNP A/B and HuR proteins share, we proceeded in the identification and characterization of putative interactions between these proteins by performing a series of immunoprecipitation assays in nuclear and cytoplasmic fractions derived from A549 cells (human lung adenocarcinoma). We succeeded in identifying a broad spectrum of HuR interactions within hnRNP and mRNP complexes. More specifically, nuclear interactions of hnRNP A1:HuR and hnRNP C1/C2:HuR , as well as cytoplasmic hnRNPA1:HuR interactions were characterized. These associations refer to protein/RNA interactions. In addition, the ability of HuR to make protein/protein interactions with the C-terminus of hnRNP A3, was characterized in vitro. Heat shock treatment of A549 cells modified the nuclear distribution of HuR and affected the interaction of HuR with hnRNP complexes. These findings may lead to the identification of the mRNA in the hnRNP Α1:HuR immunocomplex, in cells with or without HuR knockout, in order to investigate the biological significance of the presence of HuR in hnRNP and mRNP complexes.

Κύριος στόχος της παρούσας διατριβής ήταν η διερεύνηση της εµπλοκής πρωτεϊνών µε ικανότητα πρόσδεσης RNA (πρωτεΐνες RBP) στην επαγωγή και εξέλιξη καρκίνου του πνεύµονα σε κυτταρικά και ζωικά πειραµατικά πρότυπα. Η µελέτη εστίασε στον ειδικό ρόλο πρωτεϊνών της οικογένειας των ετερογενών πυρηνικών ριβονουκλεοπρωτεϊνών (hnRNP), κατά κύριο λόγο στις hnRNP τύπου Α/Β (hnRNP A1, A2/B1 και A3), γνωστά σταθερά συστατικά συµπλόκων hnRNP και mRNP και µε συµµετοχή σε όλα σχεδόν τα στάδια βιογένεσης του mRNA. Παράλληλα µελετήθηκαν τα πρότυπα έκφρασης άλλων πρωτεϊνών RBP, µε έµφαση στην πρωτεΐνη HuR µε πλέον γνωστό ρόλο την σταθεροποίηση/µετάφραση mRNA-στόχων. Με δεδοµένη την βιολογική σηµασία της διαφαινόµενης συµµετοχής πρωτεϊνών hnRNP (κατεξοχήν της Α2/Β1) και της ΗuR στον ανθρώπινο καρκίνο του πνεύµονα, εφαρµόστηκαν πειραµατικά µοντέλα επαγωγής καρκίνου του πνεύµονα στον ποντικό. Συνολικά, έγινε εφικτή η εξέταση τριών διαφορετικών στελεχών ποντικού και δύο σχηµάτων χηµικής επαγωγής καρκίνου του πνεύµονα [(ουρεθάνη, και συνδυασµός αρωµατικών πολυκυκλικών υδρογονανθράκων (PAH))]. Έγινε ανοσοχηµικός προσδιορισµός των πρωτεινών hnRNP και HuR σε ολικά εκχυλίσµατα του πνεύµονα, καθώς και παράλληλη ιστολογική/ανοσοϊστοχηµική ανάλυση. Συνοπτικά, τα αποτελέσµατα που προέκυψαν από την εφαρµογή των τριών πειραµατικών µοντέλων έδειξαν απουσία σηµαντικής αύξησης έως και µείωση των επιπέδων των πρωτεϊνών στον καρκινικό έναντι του φυσιολογικού πνευµονικού ιστού. Τα ευρήµατα είναι σε γενική συµφωνία µε πρόσφατα βιβλιογραφικά δεδοµένα από τους Peebles KA et al (2007) αναφορικά µε τις αλλαγές των επιπέδων της hnRNPA2/B1. Επισηµαίνεται ότι τα αποτελέσµατα από την εφαρµογή των πειραµατικών ζωικών µοντέλων είναι σε προφανή αντιδιαστολή µε αυτά που αφορούν τις ανθρώπινες βιοψίες καρκίνου του πνεύµονα, όπου διαπιστώνεται η σε υψηλά ποσοστά υπερέκφραση των hnRNP Α/Β και HuR σε σχέση µε τον παρακείµενο φυσιολογικό ιστό. Κατά συνέπεια, σηµειώνεται η ανάγκη να ληφθούν υπόψη στην επέκταση και εφαρµογή των ζωικών µοντέλων στον ανθρώπινο καρκίνο του πνεύµονα. Με βάση γνωστά κοινά βιοχηµικά και µοριακά χαρακτηριστικά πρωτεϊνών hnRNPA/B και HuR, προχωρήσαµε στη ταυτοποίηση και τον χαρακτηρισµό των µεταξύ τους διασυνδέσεων µε την εφαρµογή πειραµάτων ανοσοκατακρήµνισης σε πυρηνικά και κυτταροπλασµατικά κλάσµατα κυττάρων Α549 (αδενοκαρκίνωµα πνεύµονα ανθρώπου). Διαπιστώθηκε η ευρεία συµµετοχή της HuR σε σύµπλοκα hnRNP και mRNP. Ειδικότερα, χαρακτηρίστηκαν πυρηνικές διασυνδέσεις της HuR µε τις hnRNP A1 και C1/C2, καθώς και κυτταροπλασµατική διασύνδεση µε την hnRNP A1, οι οποίες είναι τύπου πρωτεΐνης/RNA. Επιπλέον, διαπιστώθηκε αλληλεπίδραση πρωτεΐνης/πρωτεΐνης της HuR µε το καρβοξυτελικό άκρο της hnRNP A3, in vitro. Η επίδραση θερµικού στρες σε κύτταρα A549 είχε σαν αποτέλεσµα αλλαγή στην πυρηνική κατανοµή της HuR και στην διασύνδεσή της µε τα σύµπλοκα hnRNP. Τα αποτελέσµατα αυτά ανοίγουν τον δρόµο για την ταυτοποίηση του mRNA στο ανοσοσύµπλοκο hnRNP Α1:HuR, σε κύτταρα µε ή χωρίς απαλοιφή της HuR, προκειµένου να διερευνηθεί η βιολογική σηµασία της παρουσίας της HuR στα σύµπλοκα hnRNP και mRNP.