Σχεδιασμός και σύνθεση μοντέλων της apoA-I: μελέτη της αντιαθηρογόνου δράσης τους

Abstract

The inverse relationship between high density lipoprotein (HDL) plasma levels and atherosclerosis has been attributed to the role that HDL and its major constituent apolipoprotein A-I (apoA-I) play in reverse cholesterol transport, as well as to their antioxidant and anti-inflammatory activities. ApoA-I consists of 243 amino acids residues with molecular weight about 28 kDa and is primarily synthesized in the liver and the intestine. The encoded amino acids form 22- and 110 repeats which, based on X-ray crystallography and computer modeling are organized in ten amphipathic α-helices. Each of these repeats has a specific role for example helix 6 is responsible for the activation of the enzyme LCAT, helix 9 and 10 are involved in formation of discoidal HDL interacting with ABCA1. Moreover apoA-I has four methionine residues in position 43, 86, 112, 148 that are thought to act as oxidation scavenger and protect LDL from oxidation. Amphipathic helices of apoA-I are grouped into different classes. The most distinct feature of the class A amphipathic helix is the unique clustering of positively charged residues at the polar-nonpolar interface and of negatively charged residues at the center of the polar face. Class G helices have a random distribution of negative and positive charges around the perimeter of the polar face. With the aim of validating the role of different classes, A and G, of the amphipathic apoA-I helix 4, 6 and 9, 10 in their biological functions, eight peptide models were designed, synthesized and tested. 1. Peptide model Ac-FQKKWQEEAELYRQ-NH₂ (1), region 104-117, helix 4, Met¹¹²→Ala¹¹², class G. 2. Peptide model AC-EMRDRARAHYDAL-NH₂ (2), region 147-159, helix 6, class A. 3. Peptide model Ac-EARDRARAHVDAL-NH₂ (3), region 147-159, helix 6, Met¹⁴⁸→Ala¹⁴⁸, class A. 4. Peptide model Ac-EMNVaOmRARAAVDAL-NH₂ (4), region 147-159, helix 6, Arg¹⁴⁹·Nva¹⁴⁹, Asp¹⁵⁰·Orn¹⁵⁰, His155·Ala155, class G. 5. Peptide model Ac-ARAHVDALRTHLA-NH₂ (5), region 152-164, helix 6, class A 6. Peptide model Ac-ARAHVDALRKHLA-NH₂ (6), region 152-164, helix 6, Thr¹⁶¹→Lys¹⁶¹, class G. 7. Peptide model Ac-PALEDLRQGLLPVLESFKVSF-NH₂ (7), region 209-229 helices 9 and 10, class G. 8. Peptide model Ac-PALEOmLRQGLLPVLEKFKVSF-NH₂ (8), region 209-229 helices 9 and 10, Asp²¹³·Om²¹³, Ser²²⁴·Lys²²⁴ class A. The syntheses of peptides 1-8 were carried out manually using the Fmoc-chemistry and the stepwise solid-phase procedure; on a Rink Amide AM resin (0.67mmol/g resin). The purity of the peptides was established by semi-preparative high performance liquid chromatography (HPLC) and the correct products were confirmed by analytical HPLC and electro spay ionization mass spectrometry (ESI-MS). The conformational studies of the peptide models were performed by circular dichroism spectrometry in sodium dodecyl-sulfate (SDS) and tetradecaphosphorylcholine (C₁₄PC)/peptide mixtures in a molar ratio 80:1 and 50:1 respectively, TFE/H₂O (50/50 v/v) and PBS pH=7.4. The biological activity of the peptide models 1-8 (peptides or POPC/MLVs liposome with peptides) was tested for their ability to inhibit LDL oxidation in vitro in various concentrations. LDL (100 μg protein/mL) was incubated in the presence of copper sulfate (5 μΜ final concentration). The kinetic of the oxidations was determined by monitoring the increase in absorbance at 234 nm every 10 min for 4h. The conclusions of this work can be summarized as follow: - All the peptide models 1-8 were highly purified. - Conformational studies by circular dichroism (CD) suggest the occurrence of well-defined structures in aqueous and micelles microenvironment. - In peptide model Ac-FQKKWQEEAELYRQ-NHL (1), helix 4, region 104-117, class G, the substitution of Met in position 112 with Ala changes the conformational and biological properties of this peptide indicating the role of this amino acid in apoA-I as an antioxidant scavenger. - From the peptides models corresponding region 147-159 of helix 6, model Ac- EMNVaOmRARAAVDAL-NH₂ (4), class G, possesses the highest helical content and has the greatest antioxidant activity followed by model Ac- EMRDRARAHVDAL-NH₂ (2) and Ac-EARDRARAHVDAL-NH₂ (3) of A class. This leads to the conclusion that Met in apoA-I molecule plays an important role in LDL oxidation and the type of class is crucial for its biological activities. - Model AC-ARAHVDALRTHLA-NH2 (5), region 152-164, helix 6, class A shows a lower helical content but a better antioxidant action than model (6). This can indicate the importance of alter the class of a peptide model in its biological activity. Moreover, models (5) and (6) have no action in activation of LCAT and probably this region (152-164) of apoA-I molecule is not essential for LCAT activation. - Model Ac-PALEOmLRQGLLPVLEKFKVSF-NH₂ (8), region 209-229 helices 9 and 10, Asp213, Asp²¹³·Orn²¹³, Ser²²⁴·Lys²²⁴, class A possess higher helical content and greater biological activity than peptide model (7). This can indicate the relationship between the type of the class of helices and their biological activity.

Η αντίστροφη σχέση μεταξύ των επιπέδων της υψηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνη (HDL) στο πλάσμα και της αθηροσκλήρωσης έχει αποδοθεί στο ρόλο που διαδραματίζει η HDL και το κύριο πρωτεϊνικό συστατικό της, η απολιποπρωτεΐνη Α-Ι (apoA-I) στην αντίστροφη μεταφορά χοληστερόλης καθώς επίσης στις αντιοξειδωτικές και αντιφλεγμονώδεις δράσεις της. Η apoA-I είναι μια πρωτεΐνη που αποτελείται από 243 αμινοξέα, έχει μοριακό βάρος 28 kDa και συντίθενται κυρίως στο ήπαρ και στο έντερο. Τα αμινοξέα της apoA-I οργανώνονται σε 10 διαδοχικές αμφιπαθητικές α-έλικες: οκτώ 22-μερείς και δύο 11-μερείς (που αποτελούνται από 22 και 11 αμινοξέα αντίστοιχα) που συχνά διακόπτονται από προλίνες. Κάθε μία από αυτές τις αμφιπαθητικές έλικες έχει ένα συγκεκριμένο ρόλο. Οι λειτουργικά σημαντικές περιοχές της apoA-I είναι σήμερα πολύ καλά τεκμηριωμένες. Έτσι, το καρβοξυ-τελικό άκρο της έλικας 6 θεωρείται υπεύθυνο για την ενεργοποίηση της LCAT, ενώ το καρβοξυ-τελικό άκρο της έλικας 9 συνδεδεμένο με το αμινο-τελικό άκρο της έλικας 10 αλληλεπιδρά λειτουργικά με το μεταφορέα ABCA1. Επίσης οι έλικες 4 και 6 που περιέχουν τη Met¹¹² και Met¹⁴⁸ αντίστοιχα λειτουργούν πολύ πιθανόν και ως «παγίδες οξείδωσης», συμβάλλοντας στις αντιοξειδωτικές δράσεις της HDL. Οι μεθειονίνες του μορίου της apoA-I φαίνεται να επεμβαίνουν στις αλυσιδωτές αυτοκαταλυόμενες αντιδράσεις των λιποϋπεροξειδίων που οδηγούν στο σχηματισμό των ox- LDL σωματιδίων δεσμεύοντας τις ελεύθερες ρίζες που παράγονται. Συγκεκριμένα η apoA-I ανάγει τα λιποϋπεροξείδια (LOOH) που σχηματίζονται κατά την οξειδωτική τροποποίηση της LDL σε αντίστοιχα υδροξύλια (LOH) με ταυτόχρονη δημιουργία σουλφοξειδίου στη θέση του θείου της μεθειονίνης. Οι αμφιπαθητικές α-έλικες της apoA-I κατατάσσονται σε διάφορες τάξεις όπως είναι η A και η G. Η τάξη A χαρακτηρίζεται από ένα υψηλό μέσο όρο υδροφοβικότητας και μια κατανομή των αμινοξέων με τέτοιο τρόπο ώστε τα θετικά φορτισμένα κατάλοιπα να βρίσκονται ομαδοποιημένα στην διεπιφάνεια πολικής-μη πολικής φάσης και τα αρνητικά να βρίσκονται συγκεντρωμένα στο κέντρο της πολικής επιφάνειας ενώ η πολική πλευρά της G τάξης χαρακτηρίζεται από τυχαία εναλλαγή θετικών και αρνητικών αμινοξέων. Έχοντας υπόψη τα παραπάνω, σχεδιάστηκαν και συντέθηκαν μοντέλα των ελικοειδών τμημάτων της apoA-I ώστε να μελετηθεί διεξοδικά η αντιαθηρογόνος δράσης τους. Ο σχεδιασμός των μοντέλων της apoA-I έγινε με βάση α) τη διατήρηση της αμφιπαθητικότητας της έλικας και την παρουσία θετικών και αρνητικών φορτίων, κατά το δυνατόν, σε θέσεις i, i+3 και i+4, ώστε να σταθεροποιούνται ιοντικές αλληλεπιδράσεις στην υδρόφιλη περιοχή της έλικας, β) την αντικατάσταση της Met με Ala, και γ) τη μεταβολή της τάξης της έλικας. 1. Πεπτιδικό μοντέλο Ac-FQKKWQEEAELYRQ-NH₂ (1), περιοχή 104-117, έλικα 4, Met¹¹²→ Ala¹¹², τάξη G. 2. Πεπτιδικό μοντέλο Ac-EMRDRARAHVDAL-NH₂ (2), περιοχή 147-159, έλικα 6, τάξη A. 3. Πεπτιδικό μοντέλο Ac-EARDRARAHVDAL-NH₂ (3), περιοχή 147-159, έλικα 6, Met¹⁴⁸→Ala¹⁴⁸, τάξη A. 4. Πεπτιδικό μοντέλο Ac-EMNVaOmRARAAVDAL-NH₂ (4), περιοχή 147-159, έλικα 6, Arg¹⁴⁹·Nva¹⁴⁹, Asp¹⁵⁰·Orn¹⁵⁰, His¹⁵⁵·Ala¹⁵⁵, τάξη G. 5. Πεπτιδικό μοντέλο Ac-ARAHVDALRTHLA-NH₂ (5), περιοχή 152-164, έλικα 6, τάξη A. 6. Πεπτιδικό μοντέλο AC-ARAHVDALRKHLA-NH₂ (6), περιοχή 152-164, έλικα 6, Thr¹⁶¹→Lys¹⁶¹, τάξη G. 7. Πεπτιδικό μοντέλο Ac-PALEDLRQGLLPVLESFKVSF-NH₂ (7), περιοχή 209-229 έλικες 9 και 10, τάξη G. 8. Πεπτιδικό μοντέλο Ac-PALEOmLRQGLLPVLEKFKVSF-NH₂ (8), περιοχή 209-229 έλικες 9 και 10, Asp²¹³·Orn²¹³, Ser²²⁴·Lys²²⁴ τάξη A. Η σύνθεση των πεπτιδικών μοντέλων της apoA-I, έγιναν σύμφωνα με τις αρχές της σύνθεσης των πεπτιδίων σε στερεή φάση κατά Merrifield ακολουθώντας την Fmoc στρατηγική με στερεό υπόστρωμα την ρητίνη RINK Amide AM (υποκατάσταση 0.67 mmol/g ρητίνης) ώστε τα πεπτίδια να απελευθερωθούν ως αμίδια. Πριν από την αποκοπή τους από τη ρητίνη έγινε ακετυλίωση της αμινοτελικής ομάδας των πεπτιδίων. Ο καθαρισμός των πεπτιδικών αναλογών 1-8 έγινε με χρωματογραφία υψηλής διακριτικής ικανότητας HPLC αναλυτικής και ημιπαρασκευαστικής και τα σωστά προϊόντα ελέγχθηκαν με φασματοσκοπία μάζας ESI-MS. Όλα τα πεπτιδικά μοντέλα μελετήθηκαν ως προς τη διαμόρφωση που αποκτούν σε διάφορους διαλύτες με φασματοσκοπία κυκλικού διχρωϊσμού. Η συγκέντρωση των πεπτιδίων σε όλα τα πειράματα ήταν 100μΜ. Για τη διεξαγωγή των πειραμάτων χρησιμοποιήθηκαν οι παρακάτω διαλύτες: Ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών, PBS buffer pH 7.4, διάλυμα δωδεκυλοθειϊκού νατρίου, SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) σε συγκέντρωση 8 mM, μίγμα τριφθοροαιθανόλης/νερού, TFE/H₂0 50/50 (v/v) και διάλυμα δεκατετραφωσφορυλοχολίνης C₁₄PC σε συγκέντρωση 5 mM. Τα βιολογικά πειράματα περιλαμβάνουν την οξειδωτική τροποποίηση της LDL in vitro παρουσία τόσο των πεπτιδικών μοντέλων όσο και των συμπλεγμάτων POPC/MLVs που εμπεριείχαν τα μοντέλα. Η οξείδωση της LDL αρχίζει με την προσθήκη διαλύματος δισθενών ιόντων χαλκού στους 37°C. Η πορεία της οξείδωσης παρακολουθείται φασματομετρικά καταγράφοντας τη σιγμοειδή καμπύλη οξείδωσης στα 234 nm. Τα συμπεράσματα της παρούσας διδακτορικής διατριβής συνοψίζονται στα εξής: - Παρασκευάστηκαν και μελετήθηκαν, ως προς τις βιολογικές και διαμορφωτικές τους ιδιότητες, πεπτιδικά μοντέλα της απολιποπρωτεΐνης Α-Ι (apoA-I), η οποία αποτελεί κύριο συστατικό της HDL και ευθύνεται για πολλές από τις αντιαθηρογόνες δράσεις της. - Τα πεπτιδικά μοντέλα που παρασκευάστηκαν είναι μοντέλα των ελίκων 4, 6 και 9-10. Όλα τα πεπτιδικά ανάλογα παρασκευάστηκαν σε καλές αποδόσεις με υψηλή καθαρότητα όπως προκύπτει από τα φάσματα μάζας και τις αναλυτικές HPLC των πεπτιδικών αναλογών 1-8. - Τα χαρακτηριστικά α-έλικας φαίνεται να κυριαρχούν σε όλους τους διαλύτες SDS, TFE/H₂0 και C₁₄PC που μελετήθηκαν εκτός του PBS pH 7.4. - Στο μοντέλο 1 που ανήκει στην περιοχή 104-117 με αντικατάσταση της μεθειονίνης στη θέση 112 με αλανίνη, τάξης G, συμπεραίνουμε πως η αλλαγή αυτή μειώνει τον αντιοξειδωτικό ρόλο του συγκεκριμένου πεπτιδίου και αναδεικνύει τη σημασία της μεθειονίνης ως παγίδα οξείδωσης στην έλικα 4. - Για τα πεπτιδικά μοντέλα της έλικας 6 περιοχή 147-159, παρατηρούμε πως το μοντέλο 4 που ανήκει στην τάξη G παρουσιάζει τις καλύτερες αντιοξειδωτικές δράσεις ενώ τα μοντέλα 2 και 3 έχουν παρόμοια αντιοξειδωτική δράση που είναι καλύτερη σε μεγάλες συγκεντρώσεις π.χ. 424 μΜ πεπτιδίου. Τα αποτελέσματα αυτά υπογραμμίζουν τη σημασία στα δομικά χαρακτηριστικά της έλικας σε σχέση με τη βιολογική δράση μιας και η τάξη G διαφέρει σημαντικά από την Α. - Το πεπτιδικά μοντέλο 5, περιοχή 152-164, έλικα 6, τάξη A εμφανίζει ένα μικρότερο ποσοστό ελικοειδούς διαμόρφωσης αλλά μια καλύτερη αντιοξειδωτική δράση συγκριτικά με το πεπτιδικά μοντέλο 6 τάξης G. Επιπλέον τα πεπτιδικά μοντέλα 5 και 6 δεν έχουν καμμία δράση στην ενεργοποίηση του ενζύμου LCAT και πιθανόν αυτή η περιοχή της apoA-I να μην είναι απαραίτητη για την ενεργοποίηση του ενζύμου. - Το πεπτιδικά μοντέλο 8, περιοχή 209-229 των ελίκων 9 και 10 τάξης A παρουσιάζει καλύτερα βιολογικά και διαμορφωτικά χαρακτηριστικά συγκριτικά με το μοντέλο 7 που ανήκει στην τάξη G. Τα αποτελέσματα αυτά επιβεβαιώνουν τη σημασία στα δομικά χαρακτηριστικά της έλικας σε σχέση με τη βιολογική δράση.