Μελέτη αλληλεπίδρασης ινωδογόνου - επιφανειών με τη χρήση του μικροσκοπίου ατομικής δύναμης

Abstract

Αντικείμενο της διδακτορικής διατριβής ήταν η διερεύνηση των μηχανισμών προσρόφησης των πρωτεϊνών και η μέτρηση των δυνάμεων απoκόλλησής τους από την επιφάνεια τεχνητών υλικών. Ως βασικό εργαλείο για τα πειράματα χρησιμοποιήθηκε το Μικροσκόπιο Ατομικής Δύναμης (AFM), με το οποίο ελήφθησαν εικόνες από δείγματα μέσα σε υδατικό διάλυμα καθώς και καταγράφηκαν οι δυνάμεις αλληλεπίδρασης μορίων με επιφάνειες. Η πρωτεΐνη ινωδογόνο επιλέχθηκε για τη μελέτη εξαιτίας της σημασίας της για τη βιοσυμβατότητα των βιοϋλικών, καθώς ο πολυμερισμός της σε ινώδες είναι δυνατό να καταλήξει στο σχηματισμό θρόμβων. Ως υποστρώματα προσρόφησης χρησιμοποιήθηκαν η μίκα και το γυαλί λόγω της απαίτησης λείων επιφανειών για το AFM. Το πρώτο στάδιο της έρευνας περιελάμβανε την ποσοτικοποίηση της προσρόφησης μεμονωμένων μορίων ινωδογόνου πάνω σε επιφάνεια μίκας υπό μεταβλητές συνθήκες ιοντικής ισχύος και pH. Στόχος ήταν η κατανόηση του τρόπου, μέσω του οποίου η κατανομή των ηλεκτροστατικών φορτίων, τόσο στα πρωτεϊνικά μόρια όσο και στην επιφάνεια, επηρεάζει την αλληλεπίδρασή τους. Η μελέτη της προσρόφησης με μεμονωμένα πρωτεϊνικά μόρια, αντί του συνήθους συμπαγούς στρώματος, προτιμήθηκε για να αποφευχθεί η παρεμβολή των πλευρικών αλληλεπιδράσεων μεταξύ των μορίων στο τελικό αποτέλεσμα. Έτσι, οι εικόνες, οι οποίες ελήφθησαν με την τεχνική της ταλαντούμενης ακίδας σε φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα και η στατιστική ανάλυση της επιφανειακής κάλυψης στις διάφορες συνθήκες διαλύματος έδειξαν ότι η ισορροπία των απωστικών ηλεκτροστατικών δυνάμεων και των δυνάμεων ενυδάτωσης με τις ελκτικές van der Waals καθορίζει την έκβαση της προσρόφησης από τα πρώτα στάδιά της, όταν δηλαδή την επιφάνεια προσεγγίζουν ανεξάρτητα πρωτεϊνικά μόρια. Περαιτέρω διερεύνηση του ρόλου της ιοντικής ισχύος και του pH στην αλληλεπίδραση ινωδογόνου?επιφανειών επιχειρήθηκε με μέτρηση της δύναμης έλξης και αποκόλλησης ακίδων του AFM από δείγματα μίκας. Οι ακίδες είχαν προηγουμένως τροποποιηθεί με μικροσφαιρίδια, στην επιφάνεια των οποίων είχε προσδεθεί ομοιοπολικά, με κατάλληλη χημική διαδικασία, ένα στρώμα μορίων ινωδογόνου. Οι καμπύλες προσέγγισης?απομάκρυνσης, οι οποίες περιγράφηκαν θεωρητικά με βάση το με βάση το μοντέλο DLVO, απέδειξαν την ύπαρξη συσχέτισης ανάμεσα στις μετρούμενες δυνάμεις και το βαθμό προσρόφησης στις διάφορες συνθήκες. Ειδικότερα οι μετρήσεις σε pH 3.5 έδωσαν ισχυρές ενδείξεις για αλλαγές της μοριακής διάταξης του ινωδογόνου, οι οποίες μπορούν να συσχετιστούν με τις ενζυμικά καταλυόμενες αναδιατάξεις της δομής του κατά το σχηματισμό του ινώδους. Η τελευταία ομάδα των πειραμάτων επικεντρώθηκε στη μέτρηση της δύναμης αποκόλλησης μεμονωμένων μορίων ινωδογόνου από την επιφάνεια γυαλιού. Για το σκοπό αυτό η πρωτεΐνη προσδέθηκε ομοιοπολικά στις ακίδες του AFM μέσω αλυσίδων πολυαιθυλενικής γλυκόλης (PEG), αφού πρώτα εξετάστηκαν τρεις διαφορετικές τεχνικές επιφανειακής χημικής τροποποίησης (3? αμινοπροπυλο?τριαιθοξυσιλάνιο, αιθανολαμίνη και 3?αμινοπροπυλο?διμεθυλ?αιθοξυσιλάνιο).