Περίληψη
Η μελέτη της ειδικότητας ενός αντισώματος ακόμη και από την απουσία οποιασδήποτε γνώσης για το αντιγόνο που προκάλεσε την ανοσολογική αντίδραση είναι εφικτή με τη χρήση των τεχνικών των τυχαίων πεπτιδικών βιβλιοθηκών οι οποίες αναπτύχθηκαν τελευταία. Αυτές οι βιβλιοθήκες αποτελούνται από έναν μεγάλο αριθμό διαφορετικών πεπτιδίων σταθερού μήκους των οποίων η αμινοξική αλληλουχία δημιουργείται από την τυχαία συνθετική διαδικασία. Όλα τα απαραίτητα αμινοξέα μπορούν ενσωματωθούν σε κάθε θέση ενός δεδομένου πεπτιδίου. Συνήθως ο φορέας όπου εκφράζεται η βιβλιοθήκη είναι ο βακτηριοφάγος Μ13. Η πεπτιδική βιβλιοθήκη δημιουργείται με την εισαγωγή μικρών συνθετικών εκφυλισμένων ολιγονουκλεοτιδίων στο γονίδιο gIII στο σημείο που αντιστοιχεί στο αμινικό τέλος της πρωτεΐνης pIII της ουράς του βακτηριοφάγου. Έτσι τα πεπτίδια με τα τυχαία αμινοξέα εκφράζονται στην ενιαία πρωτεΐνη και εύκολο να έρθουν σε επαφή με το υπό μελέτη αντίσωμα στα πειράματα βιοεπιλογής. Αυτού του είδους οι βιβλιοθήκες έχουν χρ ...
Η μελέτη της ειδικότητας ενός αντισώματος ακόμη και από την απουσία οποιασδήποτε γνώσης για το αντιγόνο που προκάλεσε την ανοσολογική αντίδραση είναι εφικτή με τη χρήση των τεχνικών των τυχαίων πεπτιδικών βιβλιοθηκών οι οποίες αναπτύχθηκαν τελευταία. Αυτές οι βιβλιοθήκες αποτελούνται από έναν μεγάλο αριθμό διαφορετικών πεπτιδίων σταθερού μήκους των οποίων η αμινοξική αλληλουχία δημιουργείται από την τυχαία συνθετική διαδικασία. Όλα τα απαραίτητα αμινοξέα μπορούν ενσωματωθούν σε κάθε θέση ενός δεδομένου πεπτιδίου. Συνήθως ο φορέας όπου εκφράζεται η βιβλιοθήκη είναι ο βακτηριοφάγος Μ13. Η πεπτιδική βιβλιοθήκη δημιουργείται με την εισαγωγή μικρών συνθετικών εκφυλισμένων ολιγονουκλεοτιδίων στο γονίδιο gIII στο σημείο που αντιστοιχεί στο αμινικό τέλος της πρωτεΐνης pIII της ουράς του βακτηριοφάγου. Έτσι τα πεπτίδια με τα τυχαία αμινοξέα εκφράζονται στην ενιαία πρωτεΐνη και εύκολο να έρθουν σε επαφή με το υπό μελέτη αντίσωμα στα πειράματα βιοεπιλογής. Αυτού του είδους οι βιβλιοθήκες έχουν χρησιμοποιηθεί εκτενέστατα για την ανεύρεση πεπτιδίων που σχετίζονται με ανοσολογικές αντιδράσεις, υποδοχείς κυττάρων ή ακόμη και με τον καρκίνο. Στην παρούσα ερευνητική εργασία χρησιμοποιήσαμε πεπτιδικές βιβλιοθήκες βακτηριοφάγων για να ανιχνεύσουμε τα πιθανά αντιγόνα ενός μονοκλωνικού αντισώματος (SCH94.03) το οποίο έχει βρεθεί ότι επάγει την επαναμυελίνωση σε ένα πειραματικό μοντέλο απομυελινωτικής νόσου του κεντρικού νευρικού συστήματος και σε ένα αντίσωμα ολιγοκλωνικής ζώνης εγκεφαλονωτιαίου υγρού ασθενούς με σκλήρυνση κατά πλάκας. Το μονοκλωνικό αντίσωμα SCH94.03 που ανήκει σε IgM ισότυπο δημιουργήθηκε σε ποντίκια SJl/J με την εισαγωγή ομογενοποιημένου νωτιαίου μυελού από ποντίκια ίδιας φυλής. Αυτό το αντίσωμα επάγει την επανμυελίνωση σε ποντίκια SJl/J που έχουν χρόνια λοίμωξη από τον ιό Theiler. O μηχανισμός με τον οποίο ενεργεί αυτό το αντίσωμα ερευνήθηκε με ανοσοκυτταροχημεία, κυτταρομετρία ροής ανοσο-ηλεκτρονική μικροσκοπία, ανοσοκαθήλωση και ανοσο-χρωματογραφία λεπτού στρώματος σε πολλές δημοσιεύσεις. Mελετήθηκαν διάφορα κύτταρα όπως αστροκύτταρα, μικρογλοιακά κύτταρα, κύτταρα του Swann, μυοβλάστες, Τ και Β λεμφοκύτταρα τα οποία δεν έδειξαν καμία αντιδραστικότητα με το αντίσωμα. Μόνο τα ολιγοδενδροκύτταρα του ποντικού παρουσίασαν αντιδραστικότητα. Αυτά τα αποτελέσματα οδήγησαν στο συμπέρασμα ότι το αντίσωμα SCH94.03 αναγνωρίζει ένα νέο αντιγόνο της επιφάνειας των ολιγοδενδροκυττάρων μέσω του οποίου επάγει την επαναμυελίνωση. Στα πειράματα αυτής της μελέτης εφαρμόσαμε την βιβλιοθήκη CW12 η οποία είχε το σχήμα S (S/R) X12 SS, την R26 με το σχήμα S (S/R) (X)12 (S/P/T/A) A (V/A/G/D/E) (X)12 SR, όπου X κάθε πιθανό αμινοξύ. Εκατόν τριάντα κλώνοι βακτηριοφάγων εξετάσθηκαν για την ειδικότητα σύνδεσης τους με το SCH94.03 χρησιμοποιώντας BSA και ένα άσχετο IgG ως αντισώματα συγκριτικού ελέγχου. Σαράντα δύο κλώνοι αποδείχθηκαν ειδικοί για το αντίσωμα SCH94.03-IgΜ.
περισσότερα
Περίληψη σε άλλη γλώσσα
The study of antibody specificity, even in the absence of any knowledge about the inducing antigen, is possible using recently developed technologies based on random peptide libraries (RPLs). This is an “operational” approach since in selecting ligands from phage peptide library there is not prior structural information of the target. RPLs represent a large collection of peptides of fixed length. All possible amino acid residues are incorporated at each position of any given peptide. Usually the expressing vehicle is the bacteriophage M13. The peptide library has been generated by introducing short synthetic degenerate oligonucleotides into the viral M13 genome (gIII gene) at the point that corresponds as the N-terminal end of pIII viral coat protein. The short peptides with random aminoacid sequence are expressed as fusion parts of the pIII protein that is displayed on viral surface and is accessible during screening experiments. These RPLs have been used extensively for the identific ...
The study of antibody specificity, even in the absence of any knowledge about the inducing antigen, is possible using recently developed technologies based on random peptide libraries (RPLs). This is an “operational” approach since in selecting ligands from phage peptide library there is not prior structural information of the target. RPLs represent a large collection of peptides of fixed length. All possible amino acid residues are incorporated at each position of any given peptide. Usually the expressing vehicle is the bacteriophage M13. The peptide library has been generated by introducing short synthetic degenerate oligonucleotides into the viral M13 genome (gIII gene) at the point that corresponds as the N-terminal end of pIII viral coat protein. The short peptides with random aminoacid sequence are expressed as fusion parts of the pIII protein that is displayed on viral surface and is accessible during screening experiments. These RPLs have been used extensively for the identification of peptides associated with autoimmune responses or even cancer. In this project we used phage-displayed random peptide libraries to search for target antigen(s) for a monoclonal antibody (SCH94.03) that is known to promote remyelination in an experimental model of demyelinating disease of the central nervous system and in an oligoclonal antibody of cerebrospinal fluid of multiple sclerosis patients. The monoclonal antibody SCH94.03 (IgM isotype) was made in syngeneic mice by injection of spinal cord homogenate, promotes central nervous system remyelination when injected into SJL/J mice chronically infected with Theiler’s virus. The mechanism of antibody-mediated remyelination was investigated by immunocytochemistry, flow cytometry, immunoelectron microscopy, Western blotting and immuno-thin layer chromatography in many published studies. Among the primary cultured cells studied only oligodendrocytes showed strong surface reactivity. Other cell types, including astrocytes, microglia, Swann cells, myoblasts, and T and B lymphocytes, were negative. Among cell lines studied only to rat oligodendrocyte lineage cell lines showed surface reactivity with SCH 94.03. Western blotting of secondary isolated oligodendrocytes lysates revealed reactivity with multiple protein bands, whereas there was no reactivity to lipid antigens. These results raised the possibility that SCH 94.03 recognizes a novel oligodendrocyte-specific surface determinants and may act directly on oligodendrocytes to promote remyelination. In the present experiments we have employed phage peptide library CW12 which had the scheme of S (S/R) X12 SS, and R26 with the scheme S (S/R) (X)12 (S/P/T/A) A (V/A/G/D/E) (X)12 SR, where X is any possible amino acid. One hundred and thirty clones were tested for their specific binding to the SCH94.03 using BSA and an unrelated IgG as control. Forty-two clones shown specific binding to the SCH94.03-IgM.
περισσότερα