Σχεδιασμός, σύνθεση και φυσικοχημικός χαρακτηρισμός ενώσεων - μοντέλων κυτοχρωμικής c οξειδάσης

Abstract

Cytochrome c oxidase (CcO) is an important metalloenzyme of the respiratory chain in many aerobic organisms. It catalyses the four electron, four proton reduction, of oxygen to water, without releasing toxic reactive intermediates (H2O2), conserving the energy required for the biosynthesis of ATP. The catalytic active site of the enzyme consists of a heme (heme a3) and a copper atom (CuB) coordinated with three imidazoles from histidine residues. One of the copper-bound histidines is covalently connected to a tyrosine residue. Despite all the above detailed information derived from the natural enzyme many issues of the catalytic reaction still remain controversial. The synthesis and the study of biomimetic model compounds is an alternative method to elucidate the mechanism of O2 reduction. This method involves the synthesis and detailed structural and electronic characterization of model molecules (synthetic analogues) that approach or achieve one or more significant properties of a protein active site. The synthetic analogues are low molecular weight complexes and this fact makes easier the characterization and the study of these compounds. The aim of this thesis was the construction and the study of functional biomimetic model compounds that closely resemble the native enzyme active site. All complexes have a porphyrin base for the coordination of iron and a chelate with at least three nitrogen atoms for the coordination of copper ion. To adequately reproduce the structure of the heme/Cu site, these ligands also contain a phenol ring or a tyrosine molecule in order to mimic the tyrosine of the native enzyme. At first are described the synthetic routes that were followed for the preparation of the synthetic analogues. In all the cases was initially synthesised the porphyrin ring which constitutes the place of iron coordination. Afterwards, the ligand in which will be attached the copper ion and the group which resembles the tyrosine of the native enzyme were covalently linked with the porphyrin ring,. The synthesis of the model compounds is completed with the accomplishment of the metalation reactions with iron and copper. After the preparation of the biomimetic model compounds, it was examined by proton NMR spectroscopy their conformation in solution. 1H NMR spectra is a characteristic tool to probe the stereorelation between the porphyrin ring and appended substituents (copper ligand and the tyrosine molecule). This investigation consists of comparing the chemical shift of representative protons for the appended substituents before and after their attachment with the porphyrin ring. In all the cases we found that the models adopt the desirable conformation as the copper ligand and the phenol ring are situated close to the porphyrin ring.

Το ένζυμο της κυτοχρωμικής c οξειδάσης είναι ένα σημαντικό μεταλλοένζυμο της αναπνευστικής αλυσίδας σε πολλούς αερόβιους οργανισμούς. Καταλύει την αναγωγή τεσσάρων ηλεκτρονίων του οξυγόνου προς νερό χωρίς την απελευθέρωση βλαβερών ενδιαμέσων όπως το Η2Ο2. Το ενεργό κέντρο του ενζύμου αποτελείται από μια αίμη και ένα ιόν χαλκού το οποίο είναι δεσμευμένο σε τρεις ιστιδίνες. Μια από τις ιστιδίνες με τις οποίες είναι συναρμοσμένος ο χαλκός είναι ομοιοπολικά συνδεδεμένη με ένα κατάλοιπο τυροσίνης. Παρά τη σημαντική πρόοδο που έχει επιτευχθεί στον προσδιορισμό της δομής και της λειτουργίας του ενζύμου αρκετά σημεία της καταλυτικής του δράσης παραμένουν αδιευκρίνιστα. Η χημική μοντελοποίηση αποτελεί έναν εναλλακτικό τρόπο προσέγγισης για την πλήρη κατανόηση της καταλυτικής δράσης του ενζύμου. Η μέθοδος αυτή περιλαμβάνει τη σύνθεση ενώσεων-μοντέλων οι οποίες προσομοιάζουν μία ή και περισσότερες από τις βασικές ιδιότητες (δομικές ή λειτουργικές) του πρωτεϊνικού ενεργού κέντρου. Τα συνθετικά μοντέλα είναι ενώσεις μικρότερου μοριακού βάρους σε σχέση με φυσικό ένζυμο με αποτέλεσμα να είναι ευκολότερη η μελέτη τους. Στόχος της παρούσας διατριβής ήταν η σύνθεση καθώς και η μελέτη ορισμένων συνθετικών μοντέλων τα οποία προσομοιάζουν το ενεργό κέντρο της κυτοχρωμικής c οξειδάσης. Τα βιομιμητικά μοντέλα που συντέθηκαν αποτελούνται από έναν πορφυρινικό δακτύλιο ο οποίος αποτελεί τη θέση δέσμευσης του σιδήρου, καθώς και από έναν υποκαταστάτη που φέρει τουλάχιστον τρεις αζωτούχες ομάδες με τις οποίες αναμένεται να συναρμοστεί το ιόν του χαλκού. Επιπλέον σε κοντινή απόσταση από τη θέση δέσμευσης των δυο μεταλλικών ιόντων υπάρχει, είτε ένα μόριο τυροσίνης, είτε ένας φαινολικός δακτύλιος ο οποίος προσομοιάζει την τυροσίνη του φυσικού ενζύμου. Αρχικά, περιγράφονται οι συνθετικές πορείες που ακολουθήθηκαν για την παρασκευή των συνθετικών αναλόγων. Σε όλες τις περιπτώσεις αρχικά συντίθεται ο πορφυρινικός δακτύλιος ο οποίος αποτελεί τη θέση δέσμευσης του σιδήρου. Στη συνέχεια ενώνονται ομοιοπολικά με το δακτύλιο της πορφυρίνης ο υποκαταστάτης του χαλκού καθώς και η ένωση η οποία προσομοιάζει την τυροσίνη του φυσικού ενζύμου. Η σύνθεση των βιομιμητικών μοντέλων ολοκληρώνεται με την πραγματοποίηση των αντιδράσεων μετάλλωσης με το σίδηρο και το χαλκό.