Γονιδιωματική ανάλυση και λειτουργικός χαρακτηρισμός ασύνηθων συστημάτων αμινοακυλίωσης του μεταφορικού RNA σε παθογόνους μικροοργανισμούς

Abstract

Τhe term “unconventional (or unusual) aminoacylation systems” describes biosynthetic pathways that involve aminoacyl-tRNAs as essential factors, not only during protein synthesis but also in alternative processes (tRNA-dependent). During recent years, many functional genomic studies have demonstrated the unconventional role of aminoacyl-tRNAs outside protein synthesis and their participation in many different but equally essential biochemical pathways. In the first part, the present dissertation deals with the study and biochemical characterization of the role of tRNA molecules during the tRNAdependent conversion of aspartate to asparagine in the pathogen Neisseria meningitides. This pathway is catalyzed by the tRNA-dependent amidotransferase AdT). This biosynthetic pathway is present in all pathogens with known genome plays a dual role. It supplies the necessary Asn-tRNAAsn substrates for the incorporation of asparagine into nascent polypeptides, but it also plays critical role the biosynthesis of asparagine, in the organisms that lack the appropriate biosynthetic enzymes for this specific amino acid. It was found that the crucial determinant elements for recognition by bacterial amidotransferases constitute by first base-pair U1-A72 of tRNAAsn and the length and the sequence of the variable loop for the archaeal enzymes. In addition, an extra nucleotide in the Dloop of tRNAAsp is the anti-determinant element that prevents the interaction with amidotransferases. In the second part, the present dissertation deals with the study and elucidation of the tRNA-dependent synthesis of the cell wall in the pathogen Staphylococcus aureus. The peptidoglycan moiety in this specific pathogen is stabilized through characteristic pentaglycine interpeptide bridges, which are synthesized independent of ribosomal activity. As donors of glycine this pathway utilizes Gly-tRNAGly molecules. However, until today it was not known, how many which tRNAGly molecules are actually encoded, expressed and involved in this exo-ribosomal pathway of peptide synthesis. In the present dissertation was determined the exact number of genes encoding for tRNAGly isoacceptors that are expressed. In addition, biochemical studies lead to the characterization of specific tRNAGly isoacceptors as proteinogenic (those partipating solely into ribosomal protein synthesis, 2 molecules P1 and P2) and as non-proteinogenic (those devoted exo-ribosomal bacterial cell wall synthesis, 3 molecules NP1, NP2 and NEW). The study of both unconventional aminoacylation systems focuses on the essential role of tRNA molecules not only as passive adaptors during the flow of the genetic information but as key-players in essential biochemical pathways that are now considered as novel molecular targets for specific inactivation for the majority of pathogens

Ως ασυνήθη συστήματα αμινοακυλίωσης ορίζονται βιοσυνθετικά μονοπάτια τα οποία εμπλέκουν μόρια tRNA ως κεντρικούς παράγοντες, τόσο κατά τη διαδικασία της πρωτεϊνοσύνθεσης όσο και εκτός αυτής. Τα τελευταία χρόνια, λειτουργικές και γονιδιωματικές αναλύσεις έχουν δείξει ότι αμινοακυλιωμένα μόρια tRNA συμμετέχουν σε μία ποικιλία σημαντικών κυτταρικών διεργασιών πέραν της πρωτεϊνοσύνθεσης. Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η μελέτη παραγόντων που εμπλέκονται σε δύο ασυνήθη συστήματα αμινοκυλίωσης. Στο πρώτο σκέλος της διατριβής μελετήθηκε και χαρακτηρίστηκε βιοχημικά ο ρόλος των μορίων tRNA κατά την tRNA-εξαρτώμενη μετατροπή του ασπαραγινικού οξέος σε ασπαραγίνη στο παθογόνο βακτήριο Neisseria meningitidis, μία αντίδραση η οποία καταλύεται από την tRNA-εξαρτώμενη αμιδοτρανσφεράση (AdT). Η βιοσυνθετική αυτή πορεία, η οποία είναι παρούσα σε όλα τα παθογόνα βακτήρια των οποίων το γονιδίωμα είναι γνωστό, έχει διττό ρόλο. Παρέχει τα Asn-tRNAAsn υποστρώματα για την ενσωμάτωση ασπαριγίνης στις νεοσυντιθέμενες πρωτεΐνες των οργανισμών, ενώ παράλληλα παίζει σημαντικό ρόλο κατά τη βιοσύνθεση της ασπαραγίνης, όταν από τους οργανισμούς απουσιάζουν τα ένζυμα που ευθύνονται για τη βιοσύνθεση του συγκεκριμένου αμινοξέος. Βρέθηκε ότι το καθοριστικό στοιχείο αναγνώρισης του tRNAAsn από τις βακτηριακές αμιδοτρανσφεράσες είναι το πρώτο ζεύγος βάσεων U1- A72, ενώ για τα αντίστοιχα ένζυμα των αρχαίων είναι το μέγεθος και η αλληλουχία της μεταβλητής θηλιάς. Αντίστοιχα, το αντικαθοριστικό στοιχείο που παρεμποδίζει την αναγνώριση του tRNAAsp είναι το μέγεθος της θηλιάς D. Το δεύτερο ασύνηθες σύστημα αμινοακυλίωσης που μελετήθηκε ήταν η tRNA- εξαρτώμενη σύνθεση του κυτταρικού τοιχώματος του παθογόνου Staphylococcus aureus. H πεπτιδογλυκάνη του κυτταρικού τοιχώματος στο συγκεριμένο παθογόνο σταθεροποιείται από χαρακτηριστικές γέφυρες πενταγλυκίνης οι οποίες συντίθενται εξω-ριβοσωμικά. Ως δότες γλυκίνης διαμεσολαβούν Gly-tRNAGly μόρια ο αριθμός και η ταυτότητα των οποίων ήταν μέχρι σήμερα άγνωστα. Στην παρούσα διατριβή διευκρινίστηκε ο αριθμός και ο ρόλος των ισοδεκτικών μορίων tRNAGly του S. aureus που υπάρχουν και εκφράζονται στο συγκεκριμένο παθογόνο. Βρέθηκε ότι 5 ισοδεκτικά μόρια κωδικοποιούνται και εκφράζονται στο συγκεκριμένο οργανισμό. Επιπρόσθετα, με βιοχημικές προσεγγίσεις έγινε εφικτός ο διαχωρισμός τους σε εκείνα που συμμετέχουν στην πρωτεΐνοσυνθετική μηχανή (πρωτεϊνογενετικά, 2 μόρια Ρ1 και Ρ2) και σε εκείνα που εμπλέκονται στη σύνθεση του βακτηριακού κυτταρικού τοιχώματος (μη-πρωτεϊνογενετικά, 3 μόρια ΝΡ1, ΝΡ2 και NEW). H παρούσα διατριβή εστιάσθηκε στο σημαντικό ρόλο των μορίων tRNA, όχι ως απλών προσαρμοστικών μορίων, αλλά ως σημαντικών παραγόντων σε βιοχημικές διεργασίες, οι οποίες σήμερα αναγνωρίζονται στην πλειοψηφία των παθογόνων, ως νέοι μοριακοί στόχοι για εξειδικευμένη απενεργοποίηση.