Παθογένεση του κολο-ορθικού καρκίνου: ο ρόλος των αναστολέων της κυκλοοξυγενάσης, του συστήματος ουβικουϊτίνης-πρωτεασώματος και πειραματικές εφαρμογές

Abstract

Background: Cyclooxygenase-2 (Cox-2) is an important enzyme in colorectal carcinogenesis and Cox inhibitors such as aspirin (acetylsalicylic acid, ASA) have shown both Cox-2 dependent and independent anti-neoplastic activities in diverse models. The Ubiquitin-Proteasome system (UPS) is a multi-unit protease system that regulates the abundance and function of a growing number of cell proteins and its inhibition results in cancer cell growth inhibition and apoptosis and is already exploited in the clinic with the use of proteasome inhibitor bortezomib in multiple myeloma. Materials and methods: Human colorectal cancer cells lines HCT116, HT-29 and CaCo2 growing in RPMI1640 medium in the presence or absence of ASA and bortezomib were used in the experiments. MTT assay, trypan blue exclusion and DNA fragmentation were the assays used for the measurement of cell proliferation and apoptosis after drug exposure. Cox and proteasome activity were measured with a colorimetric and a fluorimetric method respectively. The expression of proteins at base line and after drug exposure was determined by western blotting. Results: Bortezomib together with aspirin inhibit the growth of colorectal cancer cell lines HCT116, HT-29 and CaCo2 more than each drug alone. In both HCT116 and HT-29 cell lines ASA inhibitory effects are Cox-2 independent because HCT116 cells do not express the enzyme while in HT-29 cells Cox-2 has no activity as shown by a Cox activity assay. In CaCo2 cells that express enzymatically active Cox-2 the extent of Cox-2-dependent and independent mechanisms in mediating anti-neoplastic activity of the drug combination remains to be determined. Cell cycle inhibitors p21 and p27 are induced in the three cell lines by bortezomib and the combination treatment. akt1 kinase is down-regulated in all three lines by the same treatments. Transcription factor NF-κB is retained in the cytoplasm by drug treatment in cell lines HCT116 and HT-29, a fact that may play a role in their pro-apoptotic activity. Pro-apoptotic bcl-2 family member, bad is down-regulated in cell lines HCT116 and CaCo2 by bortezomib treatment, a neoplasia-promoting event that is reversed by combination treatment. Conclusion: The combination of bortezomib and ASA co-operates to decrease proliferation and induce apoptosis in three human colorectal cell lines with different genetic lesions. These effects are at least in some cases Cox-2 independent and involve common and diverse mechanisms in the three lines.

Εισαγωγή: Οι θεραπείες στόχευσης, αποτέλεσμα της συνεχώς αυξανόμενης κατανόησης της διαδικασίας της καρκινογένεσης, εισέρχονται στην κλινική πράξη και χρησιμοποιούνται σήμερα είτε ως μονοθεραπείες είτε ως μέρος συνδυασμένης θεραπείας με κλασσικά χημειοθεραπευτικά. Η χρησιμοποίηση συνδυασμών στοχευμένων θεραπειών έχει αρχίσει επίσης να διερευνάται. Ένας τέτοιος συνδυασμός είναι αυτός των αναστολέων του πρωτεασώματος με τους αναστολείς της κυκλοοξυγενάσης-2 που αποτελεί το αντικείμενο της πειραματικής αυτής εργασίας. Υλικά και μέθοδοι: Οι σειρές ανθρώπινου κολο-ορθικού καρκίνου HCT116, HT-29 και CaCo2 καλλιεργήθηκαν σε καλλιεργητικό υλικό RPMI1640 με την παρουσία ή χωρίς της ασπιρίνης και της μπορτεζομίμπης. Για τη μέτρηση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της απόπτωσης χρησιμοποιήθηκαν οι δοκιμασίες ΜΤΤ, αποκλεισμού του κυανού του τρυπανίου και κατακερματισμού του DNA. Η δραστικότητα της Cox-2 και του πρωτεασώματος μετρήθηκαν με χρωματομετρική και φθοριομετρική μέθοδο αντίστοιχα. Η έκφραση διάφορων πρωτεϊνών σημαντικών για τη δράση των φαρμάκων προσδιορίστηκε με western blotting. Αποτελέσματα: Ο συνδυασμός της ασπιρίνης και της μπορτεζομίμπης αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό και προάγει την απόπτωση των τρειών κυτταρικών σειρών περισσότερο από ότι το κάθε φάρμακο ξεχωριστά. Η αναστολή των κυτταρικών σειρών από την ασπιρίνη είναι ανεξάρτητη από την Cox-2 στα κύτταρα HCT116 γιατί αυτά δεν εκφράζουν το ένζυμο και στα κύτταρα HT-29 γιατί το ένζυμο αν και εκφράζεται φαίνεται να είναι ανενεργό. Στα κύτταρα CaCo2 που εκφράζουν ένζυμικά ενεργή Cox-2 είναι πιθανό ότι τόσο Cox-2 -εξαρτώμενοι όσο και ανεξάρτητοι μηχανισμοί παίζουν ρόλο στη δράση του συνδυασμού ασπιρίνης και μπορτεζομίμπης. Ο συνδυασμός των δύο φαρμάκων επάγει τους αναστολείς των CDKs p21 και p27 και καταστέλλει την κινάση akt στις τρεις κυτταρικές σειρές. Άλλα αποτελέσματα της δράσης του συνδυασμού ασπιρίνης και μπορτεζομίμπης αφορούν στις κυτταρικές σειρές HCT116 και HT-29 την κατακράτηση του μεταγραφικού παράγοντα NF-κB στο κυτταρόπλασμα, και στις σειρές HCT116 και CaCo2 την αναστροφή της μειωμένης από την μπορτεζομίμπη έκφρασης του προ-αποπτωτικού μέλους της bcl-2 οικογένειας, Bad. Συμπέρασμα: Η συνδυασμένη έκθεση κυττάρων κολο-ορθικού καρκίνου στους αναστολείς της Cox-2 και του πρωτεασώματος αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων αυτών, προάγει την απόπτωση και αποτελεί ένα ελπιδοφόρο θεραπευτικό συνδυασμό προς περαιτέρω ανάπτυξη.