Ανάλυση φυσιολογικού ρόλου των ισοενζύμων της γλουταμικής αφυδρογονάσης σε άγριου τύπου και γενετικά τροποποιημένα φυτά καπνού (Nicotiana tabacum L.)

Abstract

Προηγούμενες εργασίες του Εργαστηρίου μας και άλλων, είχαν προτείνει ότι η γλουταμική αφυδρογονάση (Glutamate dehydrogenase, GDH, E.C. 1.4.1.2) πιθανόν είναι ένζυμο αποκρινόμενο σε καταπονήσεις καθώς είναι θερμοσταθερό (Syntichaki et al., 1996) και η de novo σύνθεση της α-υπομονάδας της, επάγεται από εξωγενή αμμωνία και γήρανση (Loulakakis and Roubelakis-Angelakis, 1992; Turano et al., 1997; Loulakakis et al., 2002; Masclaux-Daubresse et al., 2005), ενώ ο φυσιολογικός ρόλος των 7 GDH-ισοενζύμων παραμένει αδιευκρίνιστος (Davies and Teixeira, 1975; Yamaya et al., 1986; Masclaux et al., 2000; Aubert et al., 2001; Purnell et al., 2005; Masclaux-Daubresse et al., 2006; Skopelitis et al., 2006). Στην Διατριβή αυτή συνεχίστηκε η μελέτη των γονιδίων Vvgdh-NAD;A1 και Vvgdh-NAD;Β, που κωδικοποιούν για τις 2 υπομονάδες της GDH. Απομονώθηκε και χαρακτηρίστηκε η αλληλουχία του γονιδίου της β-υπομονάδας της GDH. Η αλληλουχία αυτή είχε μέγεθος 4.2Kb και αναγνωρίστηκαν 9 εξόνια και 8 εσόνια με συντηρημένες αλληλουχίες συναρμογής. Από την cDNA αλληλουχία μεγέθους 1.5Kb που απομονώθηκε, βρέθηκε ότι κωδικοποιεί για 411 αμινοξέα και περιέχει όλα τα συντηρημένα μοτίβα, που χαρακτηρίζουν την β-υπομονάδα της GDH σε άλλα φυτά. Επίσης, για την συσχέτιση ρυθμιστικών αλληλουχιών του υποκινητή με την απόκριση της GDH σε διάφορες καταστάσεις, απομονώθηκε η περιοχή του υποκινητή της α-υπομονάδας και κατασκευάστηκαν αλληλοεπικαλυπτόμενα ελλείμματα, σε σύντηξη με το γονίδιο της λουσιφεράσης. Με παροδική έκφρασή τους μέσα σε πρωτοπλάστες καπνού, χαρακτηρίστηκε η ελάχιστη περιοχή με ενεργότητα υποκινητή, μέσα στην οποία αναγνωρίστηκαν αρκετές cis ρυθμιστικές αλληλουχίες έπειτα από in silico ανάλυση, που σχετίζουν την GDH με καταπόνηση και ιστοειδική έκφραση. Ακολούθησε κατασκευή γενετικά τροποποιημένων φυτών καπνού, που υπερέκφραζαν και υποέκφραζαν την α-υπομονάδα της GDH από το αμπέλι. Στα φυτά αυτά χαρακτηρίστηκε ο αριθμός ενθέσεων του διαγονιδίου, που οδήγησε στην αύξηση ή καταστολή αντίστοιχα, μεταγράφου και πρωτεΐνης για την α-υπομονάδα της GDH. Αυτή η τροποποίηση είχε ως αποτέλεσμα της υπερέκφραση ή εξαφάνιση των πιο ανοδικών ισομορφών της GDH. Με χρήση σημασμένων υποστρωμάτων και αναστολέων των ενζύμων γλουταμινικής συνθετάσης (GS) και γλουταμικής συνθάσης (GOGAT) και ανάλυση με GC/MS, βρέθηκε ότι σε κανονικές συνθήκες ανάπτυξης, όλα τα ισοένζυμα έχουν καταβολική δράση παρέχοντας α-κετογλουταρικό οξύ από την διάσπαση του γλουταμικού οξέος και μόνο μικρή αναβολική δραστηριότητα ανιχνεύτηκε στις σειρές υπερέκφρασης. Επίσης, τα φυτά υπερέκφρασης εμφάνισαν αυξημένη βιομάζα και ανθεκτικό φαινότυπο παρουσία NaCl. Τέλος, μελετήθηκε η επίδραση της υψηλής αλατότητας στην GDH, σε φυτά καπνού και άλλα in vitro συστήματα. Βρέθηκε ότι προκάλεσε αύξηση του μεταγράφου Vvgdh-NAD;A1 και της α-υπομονάδας της GDH, προκαλώντας μετατόπιση του ισοενζυμικού προτύπου προς τα πιο ανιονικά ισοένζυμα. Η υψηλή αλατότητα παρήγαγε ενεργές μορφές οξυγόνου, οι οποίες σηματοδότησαν την επαγωγή της έκφρασης του Vvgdh-NAD;A1. Η υψηλή συγκέντρωση αμμωνίας, λόγω αυξημένης πρωτεολυτικής δραστηριότητας δεν ήταν το πρωτογενές σήμα. Η αύξηση της in vitro ενεργότητας της GDH συμφωνούσε με την in vivo αφομοίωση σημασμένων υποστρωμάτων 15ΝΗ4 και 15N-Glu, παρουσία αναστολέων της GS και GOGAT.