Μελέτη μηχανισμών περιφερικής ανοσολογικής ανοχής των CD8 T λεμφοκυττάρων σε νέο διαγονιδιακό μοντέλο TCR / αντιγόνο στο ποντίκι

Abstract

The goal of this work was to investigate how the systemic absence of TNF affects CD8 T cell tolerance to a defined autoantigen. Since TNF is known to have pleiotropic effects (pro-inflammatory, pro-apoptotic, modulation of APCs and Tregs), understanding the balance of these mechanisms in vivo is very important. To establish a suitable experimental system, we generated a novel transgenic mouse expressing influenza-NP under the pdx-1 promoter and crossed these to NP-TCR transgenic mice (F5) and TNF/Rag1-deficient backgrounds. One transgenic line, pNP31, expressed the NP and was used for all further studies. These mice expressed NP in multiple organs, notably in the pancreas, thymus, spleen and brain (RT-PCR). Initially, we began to attempt to break self-tolerance in such mice by transferring activated and non activated TcR (F5) transgenic cells recognizing the NP peptide, also in Rag1-/- and TNF-/- backgrounds. Only 2 out of more than 100 recipients developed overt diabetes and impaired glucose tolerance was seen in some mice, more in males than in females. Therefore, new double transgenic mice were generated by directly crossing the pdx1-NP (pNP31) mice with the F5 TCR transgenics. The outcome was interesting and encouraging, since approximately 40% of such double transgenics (F5/pNP31/Rag1-/-) developed diabetes when TNF was absent, whereas their TNF-expressing counterparts remained tolerant with only one out of more than 60 mice developing diabetes. Thus, the experimental model system was well suited to investigate CD8 tolerance in the absence of TNF in direct relevance to the development of autoimmune disease (type 1 diabetes). Those TNF-deficient mice with diabetes also exhibited profound insulitis, as one would expect. The fact that not all mice developed clinical disease is of interest and reminiscent of another spontaneous diabetes model, the NOD mouse.increased cellularity in these mice and explains in a quantitative way, why tolerance is lost.

Προκειμένου να μελετήσουμε πώς η απώλεια του ενδογενούς TNF επιδρά στην ανοχή των CD8+ Τ λεμφοκυττάρων, χρησιμοποιήσαμε ένα καλά χαρακτηρισμένο διαγονιδιακό για τον υποδοχέα των Τ λεμφοκυττάρων (TCR) ποντίκι, το F5. Τα κύτταρα που φέρουν τον F5 υποδοχέα αναγνωρίζουν ένα συγκεκριμένο αντιγόνο, το ΝΡ, που προέρχεται από την νουκλεοπρωτεΐνη του ιού της γρίππης. Στο εργαστήριο δημιουργήσαμε μία νέα διαγονιδιακή σειρά για το αντιγόνο ΝΡ, την pNP31. Η σειρά αυτή κατασκευάστηκε με κλωνοποίηση του υποκινητή pdx-1 μπροστά από το γονίδιο ΝΡ. Έλεγχος με RT-PCR έδειξε ότι το αντιγόνο ΝΡ εκφράζεται σε όλους τους ιστούς, συμπεριλαμβανομένου του παγκρεατικού. Τα δύο πρώτα χρόνια της διδακτορικής μου διατριβής πραγματοποιήθηκαν πειράματα ανοχής χρησιμοποιώντας το πειραματικό σύστημα στης ενδοφλέβιας μεταφοράς F5 κυττάρων σε ποντίκια-αποδέκτες pNP31. Δοκιμάστηκαν διάφορες συνθήκες μεταφοράς και τα εργαλεία που χρησιμοποιήθηκαν για τον έλεγχο της λειτουργικής κατάστασης του παγκρέατος των ζώων ήταν η καμπύλη ανοχής στη γλυκόζη και ο ιστολογικός έλεγχος. Απώλεια ανοχής στη γλυκόζη παρατηρήθηκε περισσότερο στα αρσενικά και λιγότερο στα θηλυκά και πραγματοποιήθηκαν τόσο στο Rag1+/+ όσο και στο knockout υπόβαθρο. Σε δύο από περισσότερες από 100 μεταφορές του τύπου: F5/TNF-/- ή F5->pNP31/TNF-/- που παρακολουθήθηκαν συστηματικά εμφάνισαν διαβήτη, αριθμός μικρός, για να μπορέσει να χρησιμοποιηθεί αυτή η πειραματική προσέγγιση περαιτέρω για την προαγωγή διαβήτη και τη μελέτη του ρόλου του TNF στην απώλεια της ανοχής των Τ λεμφοκυττάρων. Παράλληλα, νέα διπλά διαγονιδιακά ποντίκια δημιουργήθηκαν με την απευθείας διασταύρωση των pNP31 ποντικών με τα F5 TCR διαγονιδιακά, τα οποία υπήρχαν σε Rag1 και TNF knockout γενετικά υπόβαθρα. τα ποντίκια: είχαν μειωμένο θάνατο μετά από ενεργοποίηση in vivo.