Μελέτη των bHLH - orange πρωτεϊνών στη drosophila melanogaster: α) τρόπος δράσης των E (spl) γονιδίων κατά τη νευρογένεση, β) ανάλυση του προτύπου έκφρασης του γονιδίου Hey και της σχέσης του με το σηματοδοτικό μονοπάτι notch

Abstract

A) Neurogenesis in all animals is triggered by the activity of a group of bHLH transcription factors, the proneural proteins [i.e. Achaete (Ac) and Scute (Sc)], whose expression endows ectodermal regions with neural potential. The eventual commitment to a neural precursor fate involves the interplay of these proneural transcriptional activators with a number of other transcription factors, which fine-tune transcriptional responses at target genes. Most prominent among the factors antagonizing proneural protein activity are the HES [E(spl)] bHLH proteins. We show here that E(spl) proteins m7 and mγ are potent inhibitors of neural fate, even in the presence of excess Sc activity and even when their DNA-binding basic domain has been inactivated. Furthermore, these E(spl) proteins can efficiently repress target genes that lack cognate DNA binding sites, as long as these genes are bound by Ac/Sc activators. This activity of E(spl)m7 and mg correlates with their ability to interact with proneural activators, through which they are probably tethered on target enhancers. The co-repressor Groucho is always needed for target gene regulation. In addition, by using in vivo and in vitro assays we have discovered that the N-teminal region (including the bHLH domain) of E(spl)m7 interacts with the C-teminal domain of Sc. An important dual role for the Sc C-terminal domain is shown: on one hand it acts as a transcription activation domain and on the other it is used to recruit E(spl) proteins. In vivo, the Sc C-terminal domain is required for E(spl) recruitment in an enhancer-context dependent fashion, suggesting that in some enhancers alternative interaction surfaces can be used to recruit E(spl) proteins. As far as E(spl)m7 is concerned, the integrity of the Orange domain is important for in its activity. Analysis of reporter genes and sensory organ (bristle) patterns reveals that, in addition to this indirect recruitment of E(spl) onto enhancers via protein-protein interaction with bound Ac/Sc factors, direct DNA binding of target genes by E(spl) also takes place. B) E(spl) proteins belong to a family of bHLH proteins, called bHLH-Orange proteins. All members of this family share homology with respect to a region called the Orange domain, which is considered to play an important role in the regulation of the proteins’ intra- and intermolecular interactions and possibly thereby of their activity. Computational analysis of the Drosophila genome has shown that there are 13 representative members of this family. We were particularly interested in Hey protein. Hey protein belongs to a subgroup of bHLH-Orange proteins with distinct, evolutionarily conserved structural characteristics. Hey genes have been studied extensively in vertebrates and they have been shown to participate in numerous developmental processes such as angiogenesis and neurogenesis. They have also been shown to be novel targets of Notch signalling. Hey proteins are heterodimeric partners of Hes proteins, with which they co-operate to achieve a more efficient transcriotional repression of target genes. However, nothing is known about the corresponding gene in Drosophila. We have studied its expression pattern in various tissues and developmental stages. It has been revealed that it is always expressed in a subset of postmitotic neurons. Its expression pattern persists even after Notch signalling is seriously reduced, suggesting (at least under the present experimental conditions) that it is possibly not a target of the Notch pathway.

A) Η έναρξη της νευρογένεσης βασίζεται στην ενεργότητα ενός συνόλου bHLH μεταγραφικών παραγόντων, των προνευρικών πρωτεϊνών [όπως οι πρωτεΐνες Achaete (Ac) και Scute (Sc) στη Drosophila melanogaster], των οποίων η έκφραση προσδίδει σε εκτοδερμικές περιοχές τη δυνατότητα να ακολουθήσουν νευρική αναπτυξιακή πορεία. Η τελική δρομολόγηση προς την ταυτότητα του νευρικού προδρόμου κυττάρου εξαρτάται από τη λειτουργική σχέση μεταξύ των προνευρικών ενεργοποιητών με άλλους μεταγραφικούς παράγοντες, μεταξύ των οποίων οι, ανταγωνιστικές, HES [E(spl)] πρωτεΐνες. Οι Ε(spl)m7 και mγ είναι ισχυροί καταστολείς της νευρικής τύχης ακόμα και όταν υπάρχει περίσσεια ενεργής Sc και ακόμα και όταν η πρόσδεσή τους σε αλληλουχίες DNA έχει απενεργοποιηθεί. Επίσης, είναι ικανές να καταστείλουν γονίδια στόχους μέσω πρωτεϊνικής αλληλεπίδρασης με τις προνευρικές πρωτεΐνες ήδη προσδεδεμένες σε αντίστοιχες αλληλουχίες σε ρυθμιστικές περιοχές των γονιδίων αυτών. Για τη κατασταλτική τους δράση είναι πάντα απαραίτητο να αλληλεπιδρούν με το συγκαταστολέα Groucho. Περαιτέρω ανάλυση έδειξε ότι η αμινοτελική περιοχή της Ε(spl)m7, συμπεριλαμβανομένου της bHLH περιοχής, και η καρβοξυτελική περιοχή της Sc αληλεπιδρούν in vivo και in vitro. Η καρβοξυτελική περιοχή της πρωτεΐνης Sc ενεργοποιεί τη μεταγραφή και είναι υπεύθυνη για την στρατολόγηση της Ε(spl)m7. In vivo είναι επίσης υπεύθυνη για τη στρατολόγηση της E(spl)m7 κατά τρόπο εξαρτώμενο από τον ενισχυτή στο οποίο αυτή προσελκύεται, καθώς σε πιο σύνθετους ενισχυτές πρόσθετοι μεταγραφικοί παράγοντες παρέχουν εναλλακτικές επιφάνειες πρόσδεσης και αλληλεπίδρασης. Από την άλλη μεριά η ακεριότητα της περιοχής Orange είναι απαραίτητη για την ενεργότητα της Ε(spl) in vivo. Ανάλυση γονιδίων ανταποκριτών και του προτύπου έκφρασης των εξωτερικών αισθητηρίων οργάνων στο θώρακα ενήλικων ατόμων δείχνει ότι υπάρχουν δύο τρόποι δράσης των Ε(spl) πρωτεϊνών in vivo: α) άμεση πρόσδεση στο DNA και β) έμμεση πρόσδεση στους ενισχυτές μέσω προνευρικών πρωτεϊνών. B) Οι Ε(spl) πρωτεΐνες ανήκουν στην οικογένεια των bHLH-Orange πρωτεϊνών. Βασικό χαρακτηριστικό των πρωτεϊνών αυτών είναι η περιοχή Orange, η οποία παίζει σημαντικό ρυθμιστικό ρόλο ενδο- και διαμορικών αλληλεπιδράσεων και κατ’ επέκταση ίσως της ενεργότητάς τους. Υπάρχουν 13 αντιπρόσωποι αυτής της οικογένειας στη Drosophila melanogaster. Μεταξύ αυτών είναι η πρωτεΐνη Hey, η οποία ανήκει σε ένα διακριτό σύνολο με εξελικτικά συντηρημένα δομικά χαρακτηριστικά. Τα ομόλογα γονίδια Hey των σπονδυλωτών έχουν εξεταστεί εκτεταμένα. Φαίνεται να παίζουν ιδαίτερο ρόλο σε πληθώρα αναπτυξιακών διαδικασιών όπως η νευρογένεση και η αγγειογένεση. Επίσης, φαίνεται να είναι άμεσοι μεταγραφικοί στόχοι του σηματοδοτικού μονοπατιού Notch. Οι Hey πρωτεΐνες σχηματίζουν ετεροδιμερή με τις Hes πρωτεΐνες, με τις οποίες συνεργάζονται για την αποτελεσματικότερη μεταγραφική καταστολή γονιδίων στόχων. Επειδή τίποτα δεν είναι γνωστό για την πρωτεΐνη Hey της Drosophila melanogaster, εξετάστηκε το πρότυπο έκφρασης της και η σχέση της με το σηματοδοτικό μονοπάτι Notch. Tα αποτελέσματα δείχνουν ότι εκφράζεται σε υποσύνολο νευρώνων του ΚΝΣ και ΠΝΣ στο έμβρυο, την προνύμφη και τη νύμφη και ότι η έκφρασή της παραμένει ακόμα και όταν η σηματοδότηση Notch έχει σημαντικά μειωθεί. Επομένως, δε φαίνεται να είναι στόχος του Notch (υπό τις παρούσες πειραματικές συνθήκες).