Συγκριτική μελέτη του mRNA της κυτταροκερατίνης-19, της MASPIN και του CEA στο αίμα ασθενών με καρκίνο του μαστού και διερεύνηση των μεταβολών τους κατά τη διάρκεια της χημειοθεραπείας ή και ορμονοθεραπείας

Abstract

The purpose of this study was to investigate and compare the diagnostic value of the detection of cytokeratin 19 (CK-19), carcinoembryonic antigen (CEA) and maspin mRNA by nested RT-PCR in the peripheral blood of women with breast cancer and to develop a highly sensitive quantitative RT-PCR hybridization assay for the determination of CK-19 mRNA in peripheral blood. The tumor cell lines MCF-7 and LOVO were used in an experimental tumor cell dilution model to determine the sensitivity of the nested RT-PCR for the 3 detection markers. RT-PCR for mRNA of CK-19, CEA and maspin was performed in the peripheral blood of 54 female healthy blood donors, 28 patients with hematologic malignancies, 31 with metastatic colorectal cancer, 75 with operable and 50 with metastatic breast cancer before receiving any cytotoxic chemotherapy. Nested RT- PCR for CK-19 mRNA presented the highest sensitivity by detecting 1 tumor cell amongst IO6 PBMC in 4 out of 5 experiments. CK-19 mRNA was detected in the peripheral blood of 3.7% of healthy blood donors, 14.3% of hematologic malignancies, 33.3% of operable and 42% of metastatic breast cancer patients. CEA mRNA was undetectable in female blood donors and was detected in blood samples of 3.5% of hematologic malignancies, 19.3% of colorectal cancer and 10% of breast cancer patients. Maspin mRNA was detected in 10.6% of operable and 14% of metastatic breast cancer patients. Maspin mRNA positivity correlated with tumor size in patients with early breast cancer (p= 0.027). Subsequently, peripheral blood from 148 patients with operable (stage I and II) breast cancer, obtained before the initiation of any adjuvant therapy, was tested for the presence of CK-19 mRNA-positive cells. For patients with stage I and II breast cancer, the detection of CK-19-positive cells in the peripheral blood before adjuvant therapy was associated with a 6-fold increased risk of relapse (p=0.001). In multivariate analysis, only the presence of CK-19 mRNA-positive cells in the peripheral blood and the number of involved axillary lymph nodes (≥ 4 lymph nodes) were independent prognostic factors associated with an increased risk of disease relapse. Conversely, the Cox proportional hazard analysis indicated that the detection of CK-19 mRNA-positive cells in the peripheral blood, the number of involved axillary lymph nodes and the status of ER expression by the tumor were the only important factors affecting the duration of DFT. Our results demonstrate that RT-PCR positivity for CK-19 mRNA is the most sensitive detection marker for tumor cells in operable and metastatic breast cancer and appropriate for use in clinical practice, although nested RT-PCR for maspin mRNA appears to be more specific. The molecular detection of CK-19 mRNA-positive cells by RT-PCR in the peripheral blood of patients with stage I and II breast cancer before the initiation of adjuvant therapy has an independent prognostic value as a marker of poor clinical outcome. We have also developed a highly sensitive quantitative RT-PCR hybridization assay for the determination of CK-19 mRNA in peripheral blood. Quantitation is based on the coamplification of CK-19 mRNA with a recombinant CK-19 RNA internal standard (CK-19 RNA-IS) through RT-PCR. The biotinylated amplification products are immobilized on streptavidin coated wells, hybridized with digoxigenin labeled probes and determined through an anti-digoxigenin antibody conjugated to alkaline phosphatase by luminometric detection. The hybridization assay was validated with samples containing total RNA from known amounts of CK-19 expressing cells (MCF-7) in the presence of total RNA isolated from peripheral blood mononuclear cells (PBMN) of healthy controls and a constant amount of CK-19 RNA-IS. Luminescence ratios for CK-19 mRNA and CK-19 RNA-IS were linearly related to the primary number of MCF-7 we had used. The overall reproducibility of the assay (between-run) varied between 7.4 and 24%. The method can clearly distinguish 10 MCF-7 cells (protocol A) and 1 MCF-7 cell (protocol B) in the presence of 106 normal PBMN and is highly specific as none of the healthy controls tested (n = 26) had detectable CK-19 mRNA levels, while 6 out of 14 breast cancer patients, with verified metastasis and under chemotherapy, were found positive.

Στα πλαίσια αυτής της εργασίας ανήκει η ανάπτυξη και κλινική αξιολόγηση υπερευαίσθητων μεθόδων μοριακής διαγνωστικής για την πρώιμη ανίχνευση νεοπλασματικών κυττάρων στο αίμα ασθενών με καρκίνο του μαστού, όπως επίσης και η ανάπτυξη μεθοδολογίας για τον ποσοτικό προσδιορισμό του mRNA ενός μοριακού δείκτη καρκίνου μαστού, της κυτταροκερατίνης 19 (CK-19), στο αίμα ασθενών με καρκίνο μαστού. Αρχικά πραγματοποιήθηκε συγκριτική μελέτη ανίχνευσης του mRNA των καρκινικών δεικτών CK-19, CEA και Maspin στο περιφερικό αίμα (ΡΒΜΝ) ασθενών με νεοπλασίες με τη μέθοδο RT-PCR, και η συσχέτισή της με άλλους κλινικοπαθολογικούς παράγοντες σε ασθενείς με πρώιμο καρκίνο μαστού, πριν και μετά τη συμπληρωματική θεραπεία, όπως επίσης και με το ελεύθερο νόσου διάστημα. Βάσει των αποτελεσμάτων, η CK-19 και η Maspin ήταν οι πιό ευαίσθητες (ανιχνεύοντας μέχρι και 1 MCF-7 κύτταρο στα ΙΟ6 ΡΒΜΝ κύτταρα) συγκριτικά με το CEA (ανιχνεύοντας μέχρι και 10 COLO-205 κύτταρα στα ΙΟ6 ΡΒΜΝ κύτταρα). Όσον αφορά την ειδικότητα των μεθόδων, η CK-19 έδωσε ένα πολύ χαμηλό ποσοστό θετικών κυττάρων στο περιφερικό αίμα των υγιών αιμοδοτών (3.7%), ενώ στα δείγματα του καρκίνου του μαστού έδωσε θετικό αποτέλεσμα για το 42% των δειγμάτων. To CEA, ενώ δεν ανιχνεύεται στα ΡΒΜΝ κύτταρα των υγιών αιμοδοτών, δε φαίνεται να παρουσιάζει υψηλή ειδικότητα για τον καρκίνο του μαστού (10%), σε αντίθεση με τον καρκίνο του παχέος εντέρου (19.3%). Η ανίχνευση του mRNA της Maspin παρουσιάζει, επίσης υψηλή ειδικότητα αφού δίνει αρνητικό αποτέλεσμα για ΡΒΜΝ δείγματα υγιών αιμοδοτών, ασθενών με αιματολογικές κακοήθειες και ασθενών με μεταστατικό καρκίνο παχέος εντέρου, ενώ για τους ασθενείς με μεταστατικό καρκίνο μαστού δίνει ένα ποσοστό 14%. Τέλος πραγματοποιήθηκε ανίχνευση θετικών κυττάρων για το mRNA της CK-19 στο περιφερικό αίμα ασθενών με καρκίνο του μαστού (n=148) σε πρώιμο στάδιο, πριν την έναρξη της συμπληρωματικής θεραπείας και η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων έδειξε ότι η ανίχνευση του CK-19 mRNA δε συσχετίζεται με κανέναν από τους κλασσικούς προγνωστικούς παράγοντες. Συσχετίζοντας τον κίνδυνο υποτροπής των ασθενών με την παρουσία ή μη θετικών κυκλοφορούντων κυττάρων στο περιφερικό αίμα για το mRNA της CK-19, τα ποσοστά των ασθενών που υποτροπίασαν είναι αντίστοιχα 27.3% και 6.7%, με στατιστικά σημαντική διαφορά (p=0.001). Αυτή η ανάλυση υποδεικνύει ότι οι CK-19 mRNA+ ασθενείς έχουν κατά περίπου 6 φορές υψηλότερο κίνδυνο να υποτροπιάσει η νόσος από αυτόν των CK-19 mRNA- ασθενών. Επιπλέον, η ανίχνευση CK-19 mRNA+ κυττάρων στο περιφερικό αίμα σχετίζεται και με μειωμένο ελεύθερου νόσου διάστημα (p=0.001). Η πολυπαραγοντική μελέτη έδειξε πως μόνο η παρουσία CK-19 mRNA- Θετικών κυττάρων στο περιφερικό αίμα και ο αριθμός των διηθημένων μασχαλιαίων λεμφαδένων (≥ 4) αποτελούν ανεξάρτητους προγνωστικούς παράγοντες, σχετιζόμενοι και με αυξημένο κίνδυνο υποτροπής (p=0.042). Επιπλέον επεξεργασία των στοιχείων εφαρμόζοντας την ανάλυση παλινδρόμησης του Cox έδειξε πως εκτός από την ανίχνευση θετικών κυττάρων για το CK-19 mRNA στο περιφερικό αίμα των ασθενών (p=0.001) και τον αριθμό των διηθημένων λεμφαδένων (≥ 4 LN+) (p=0.038), σημαντική επίδραση στο ελεύθερο νόσου διάστημα παρουσιάζει και η κατάσταση των οιστρογονικών υποδοχέων (ER-) (p=0.042). Σύμφωνα με τα αποτελέσματα η CK-19 αποτελεί ένα σημαντικό παράγοντα πρόβλεψης, ιδιαίτερα για τους ασθενείς με καρκίνο του μαστού σε πρώιμο στάδιο που δεν παρουσιάζουν διήθηση λεμφαδένων. Το δεύτερο τμήμα της παρούσας μελέτης περιλαμβάνει την ανάπτυξη και αξιολόγηση μεθόδου ποσοτικού προσδιορισμού του mRNA της CK-19 στο περιφερικό αίμα ασθενών με καρκίνο μαστού. Η μέθοδος που αναπτύχθηκε αποτελεί συνδυασμό της ανταγωνιστικής RT- PCR (πρωτόκολλο Α) ή και nested-PCR (πρωτόκολλο Β) και δοκιμασίας υβριδισμού σε μικροπλακίδια με χημειοφωταυγή ανίχνευση. Βασίζεται στην ταυτόχρονη ενίσχυση του mRNA της CK-19 με ένα ανασυνδυασμένο, ειδικά σχεδιασμένο εσωτερικό πρότυπο, ανάλογο του mRNA της CK-19, με τη μέθοδο της RT-PCR. Το εσωτερικό πρότυπο (RNA-IS) συνετέθει μέσω PCR αντιδράσεων, είναι του ίδιου μεγέθους και διαθέτει τις ίδιες θέσεις αναγνώρισης των εκκινητών με το mRNA της CK-19, ενώ διαφέρουν ως προς μια κεντρική αλληλουχία 21 βάσεων. Τα προϊόντα της RT-PCR επισημαίνονται με βιοτίνη μέσω κατάλληλων εκινητών και ακινητοποιούνται σε φρεάτια επικαλυμμένα με στρεπταβιδίνη. Τα ακινητοποιημένα υβρίδια ανιχνεύονται μέσω αντισωμάτων, συζευγμένων με αλκαλική φωσφατάση, έναντι της διγοξιγενίνης και ενός χημειοφωταυγούς υποστρώματος. Ο λόγος των αναλυτικών σημάτων (ένταση χημειοφωταύγειας) για την CK-19 και το εσωτερικό πρότυπο είναι ανάλογος του αριθμού των μορίων του mRNA της CK-19 στο δείγμα πριν την αντίδραση RT-PCR, το οποίο και αντιστοιχεί σε ένα σχετικό αριθμό κυττάρων. Η μέθοδος αναπτύχθηκε και βελτιστοποιήθηκε χρησιμοποιώντας RNA δείγματα της καρκινικής κυτταρικής σειράς MCF-7. Οι λόγοι των αναλυτικών σημάτων του CK-19 RNA και του CK-19 mRNA-IS ήταν γραμμικά ανάλογοι με τον αρχικό αριθμό των MCF-7 κυττάρων που χρησιμοποιήθηκαν. Η εντός προσδιορισμού επαναληπτικότητα της μεθόδου, περιλαμβάνοντας το σύνολο της πειραματικής διαδικασίας, ήταν μεταξύ 7.4-24%. Τα όρια ανίχνευσης των δύο πρωτοκόλλων είναι τα 10 και το 1 καρκινικό κύτταρο στο 1x106 φυσιολογικά κύτταρα, αντίστοιχα. Η ευαισθησία και η ειδικότητα της μεθόδου δοκιμάστηκε σε μελέτη 26 φυσιολογικών δειγμάτων, όπου δεν ανιχνεύθηκε CK19-mRNA, ενώ σε δείγματα 14 ασθενών σε μεταστατικό στάδιο της νόσου το αποτέλεσμα (42.8%) φανερώνει την κλινική σημασία της εφαρμογή της.