Μηχανισμοί νευροεκφύλισης και νευροπροστασίας στο γενετικό μοντέλο ντοπαμινεργικής απονεύρωσης μυός weaver

Abstract

Parkinson’s disease (PD) is characterized by the progressive degeneration of the nigrostriatal dopaminergic innervation that leads to motor disturbances. It is considered to be a multifactor disease, the etiology of which still remains unknown. Since currently available treatments are only symptomatic, having severe side-effects, neuroprotection from the early stages of the disease has been given much attention as a promising approach to PD management. Indeed, a broad range of agents has been investigated for their neuroprotective role in neurotoxical models of acute dopaminergic degeneration. “Weaver” mutant mouse represents a unique genetic model, in which the nigrostriatal neurodegeneration occurs endogenously and progressively, starting after postnatal day 7 (P7) and reaching 50% at P21. In the present study, aiming to identify neuroprotective mechanisms in the early progression of the “weaver” degenerative process and to achieve a potentially pleiotropic therapeutic action, we applied three pharmaceutical agents with different mechanisms of action, as well as a scheme combining them. Specifically, “weaver” mice were treated, individually and in combination, with N-acetylcysteine (NAC) (antioxidant), aspirine (anti-inflammatory) and 17b-estradiol [E2] (antioxidant, antiapoptotic, neurotrophic) daily, from P1 to P21. The neuroprotective effect was evaluated by immunohistochemical detection of dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra (SNpc) of treated animals. The administration of ΝΑC and aspirine did not influence the survival of (DA) neurons of weaver mice. On the contrary, the administration of 17b estradiol led to significant survival of DA neurons of SNpc, approximately 48%, in weaver mice that received E2, comparatively with weaver mice that received saline. Moreover the administration of the combination of the three drugs (cocktail) promoted the survival of DA neurons of SNpc, approximately 86% to a higher degree. Weaver mice that received cocktail had 26% more DA neurons compared to weaver mice that received individually 17b estradiol, proposing a possible synergistic action between 17b estradiol and NAC. The investigation of mechanism of neurodegeneration in SNpc and provided neuroprotection by 17b estradiol and cocktail, was realised in two levels. Initiall, by determination of oxidative stress markers, like lipid peroxidation and markers of cellular thiol redox (GSH, GSSG, CSH NPSSC, PSH, PSSP, NPSH, NSPSSR). The determination of lipid peroxidation was realised in the midbrain and striatum of normal and weaver mice that received saline (saline +/+ and saline wv/wv), 17 b estradiol (17b +/+ and 17b wv/wv) cocktail (cocktail +/+ and cocktail wv/wv). Lipid peroxidation levels in the midbrain were increased about 98% in saline wv/wv mice comparatively with the saline +/+, showing the presence of intense oxidative stress in the weaver mutant mouse. It was interesting, however, the fact that lipid peroxidation was inhibited approximately 27% in 17b wv/wv mice, while it was reverted at the normal levels in cocktail wv/wv mice. Regarding to the other oxidative markers that were examined, only NPSSC showed differences between saline +/+ and saline wv/wv, while the GSSG, PSSP and PSH followed similar increasement in both cocktail +/+ and cocktail wv/w animals. This observation indicates that these markers alone cannot give a clear figure of oxidative situation, as they constitute rapidly altered components of antioxidant cycles. Afterwards, we investigated the expression of genes Lasp1, Supt14h, Nr4a2 (nurr1), Dlg4 and serotonin transporter’s gene (SERT), which appear to be involved in neurodegeneration pathways, in the midbrain ant striatum of normal and weaver mice. There were not observed differences in their expression levels (using the RT-PCR technique) in both regions investigated. The results of the present study, lead to the conclusion that 17b-estradiol provided important neuroprotection in the DA neurons, for the first time, in a model of in vivo, endogenous, progressive dopaminergic degeneration, the weaver model. The mechanism of E2’s neuroprotective effect appears to be antioxidant as the administration of E2 suspends lipid peroxidation. Moreover the E2’s neuroprotective effect was strengthened significantly by the co-treatment of NAC, proposing the existence of synergy between E2 and GSH, for the first time in an in vivo model of neurodegeneration. The reinforced cocktail’s result gives an additional argument in the hypothesis of antioxidant mechanism of E2’s action, as cocktail, at the same time, restores lipid peroxidation in normal levels. These observations propose E2 as a future candidate pharmaceutic treatment for neurodegenerative situations, like PD, of course for female individuals. Moreover they propose that the combined treatment of E2 and NAC, can lead to the application of lower and, in consequence, less aggravating doses, concerning the side effects, that will lead to same or even higher neuroprotective result with the individual administration of 17b-estradiol.

Η νόσος του Πάρκινσον χαρακτηρίζεται από την προοδευτική εκφύλιση της μελαινοραβδωτής ντοπαμινεργικής οδού που οδηγεί σε κινητικές διαταραχές. Θεωρείται πολυπαραγοντική νόσος, η αιτιολογία της οποίας παραμένει άγνωστη. Με δεδομένο ότι η διαθέσιμη φαρμακευτική αγωγή της νόσου στηρίζεται στη συμπτωματολογία της και έχει σοβαρές παρενέργειες, η νευροπροστασία από τα πρώϊμα στάδια της νόσου αποτελεί τομέα έντονης έρευνας. Τα τελευταία χρόνια, ένα ευρύ φάσμα παραγόντων ερευνήθηκε ως προς το νευροπροστατευτικό τους ρόλο σε νευροτοξικά μοντέλα οξείας ντοπαμινεργικής εκφύλισης. Ο μεταλλαγμένος μυς “weaver” αποτελεί ένα μοναδικό γενετικό μοντέλο μελαινοραβδωτής νευροεκφύλισης, η οποία λαμβάνει χώρα ενδογενώς και προοδευτικά, αρχίζοντας μετά την 7η μετεμβρυϊκή ημέρα (Ρ7) και προσεγγίζοντας το 50% την 21η μετεμβρυϊκή ημέρα (Ρ21). Στην παρούσα μελέτη, προκειμένου να διερευνηθούν νευροπροστατευτικοί μηχανισμοί κατά τα πρώτα στάδια της νευροεκφυλιστικής διαδικασίας στο μυ “weaver”, και να επιτευχθεί μία πλειοτροπική θεραπευτική δράση, χορηγήθηκαν τρεις φαρμακευτικοί νευροπροστατευτικοί παράγοντες με διαφορετικούς μηχανισμούς δράσης καθώς και ένα σχήμα συνδυασμού τους. Συγκεκριμένα, χορηγήθηκαν, μεμονωμένα και σε συνδυασμό, στους μυς “weaver” N-ακετυλοκυστεΐνη (ΝAC) (αντιοξειδωτική δράση), ασπιρίνη (αντιφλεγμονώδης δράση) και 17β οιστραδιόλη [Ε2] (αντιοξειδωτική, αντιαποπτωτική, νευροτροφική δράση) σε καθημερινή βάση από την Ρ1 μέχρι την Ρ21. Το νευροπροστατευτικό αποτέλεσμα αξιολογήθηκε με ανοσοϊστοχημικό προσδιορισμό των ντοπαμινεργικών νευρώνων της συμπαγούς μοίρας της μέλαινας ουσίας (SNpc) των μυών στους οποίους χορηγήθηκαν τα παραπάνω φάρμακα. Η χορήγηση των NAC και ασπιρίνης δεν επηρέασε την επιβίωση των ντοπαμινεργικών νευρώνων (DA) των weaver μυών. Αντίθετα η χορήγηση της 17β οιστραδιόλης οδήγησε σε σημαντική επιβίωση των DA νευρώνων της SNpc, της τάξης του 48%, στους weaver μυς που έλαβαν την αγωγή, συγκριτικά με τους weaver μυς που έλαβαν φυσιολογικό ορό. Επιπλέον η χορήγηση του συνδυασμού των τριών φαρμάκων (cocktail) προώθησε σε ακόμα μεγαλύτερο βαθμό την επιβίωση των DA νευρώνων της SNpc, σε ποσοστό 86%. Οι weaver μύες που έλαβαν το cocktail εμφάνισαν 26% περισσότερους DA νευρώνες σε σύγκριση με τους weaver μυς που έλαβαν μεμονωμένα 17β οιστραδιόλη προτείνοντας πιθανή συνεργιστική δράση μεταξύ 17β οιστραδιόλης και NAC. Η διερεύνηση του μηχανισμού της νευροεκφύλισης στην SNpc και της παρεχόμενης νευροπροστασίας από τη χορήγηση της 17β οιστραδιόλης και του cocktail πραγματοποιήθηκε σε δύο επίπεδα. Αρχικά με τον προσδιορισμό μιας σειράς δεικτών οξειδωτικού στρες όπως η υπεροξείδωση λιπιδίων και δείκτες της θειολικής κατάστασης του κυττάρου (GSH, GSSG, CSH NPSSC, PSH, PSSP, NPSH, NSPSSR). Ο προσδιορισμός της υπεροξείδωση λιπιδίων πραγματοποιήθηκε στο μεσεγκέφαλο και το ραβδωτό σώμα των φυσιολογικών και weaver μυών που έλαβαν φυσιολογικό ορό (saline +/+ και saline wv/wv), 17 β οιστραδιόλη (17β +/+ και 17β wv/wv) cocktail (cocktail +/+ και cocktail wv/wv). Τα επίπεδα της υπεροξείδωσης λιπιδίων, στο μεσεγκέφαλο, αυξήθηκαν περίπου κατά 98% στους saline wv/wv μυς συγκριτικά με τους saline +/+ δείχνοντας παρουσία έντονου οξειδωτικού στρες στην παθολογική κατάσταση των weaver μυών. Ήταν ενδιαφέρον όμως το γεγονός ότι η λιπιδική υπεροξείδωση ανεστάλη σε ποσοστό 27% στους 17β wv/wv ενώ επανήλθε στα φυσιολογικά επίπεδα στους cocktail wv/wv μύες. Από τους υπόλοιπους δείκτες που εξετάστηκαν μόνο το NPSSC έδειξε διαφορές μεταξύ saline +/+ και saline wv/wv, ενώ οι GSSG, PSSP και PSH ακολούθησαν παρόμοια αύξηση στους cocktail +/+ και cocktail wv/w. Οι παρατηρήσεις αυτές δείχνουν ότι οι συγκεκριμένοι δείκτες από μόνοι τους δεν μπορούν να δώσουν σαφή εικόνα της οξειδωτικής κατάστασης, καθώς αποτελούν ταχέως μεταβαλλόμενα συστατικά αντιοξειδωτικών κύκλων. Στη συνέχεια διερευνήθηκε η έκφραση των γονιδίων Lasp1, Supt14h, Nr4a2 (nurr1), Dlg4 και του γονιδίου του μεταφορέα της σεροτονίνης (SERT), τα οποία φαίνονται να εμπλέκονται στα μονοπάτια της νευροεκφύλισης, στη μεσεγκεφαλική περιοχή και στο ραβδωτό σώμα των weaver μυών. Δεν παρατηρήθηκαν διαφορές στα επίπεδα έκφρασής τους με χρήση της τεχνικής RT-PCR σε καμία από τις υπό εξέταση περιοχές. Τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας οδηγούν στο συμπέρασμα ότι η 17β-οιστραδιόλη παρείχε σημαντική νευροπροστασία στους ντοπαμινεργικούς νευρώνες, για πρώτη φορά, ενός μοντέλου in vivo, ενδογενούς, προοδευτικής μελαινοραβδωτής νευροεκφύλισης, του μοντέλου weaver. Στο μηχανισμό της νευροπροστατευτικής δράσης της Ε2 φαίνεται να παίζει σημαντικό ρόλο η αντιοξειδωτική της δράση αφού η χορήγησή της αναστέλλει τη λιπιδική υπεροξείδωση. Επιπλέον η νευροπροστατευτική δράση της Ε2 ενδυναμώθηκε σημαντικά κατά τη συγχορήγηση του NAC, προτείνοντας την ύπαρξη συνέργειας μεταξύ της Ε2 και της GSH, για πρώτη φορά σε ένα in vivo μοντέλο νευροεκφύλισης. Η ενίσχυση του νευροπροστατευτικού αποτελέσματος από το cocktail δίνει ένα πρόσθετο επιχείρημα στην υπόθεση του αντιοξειδωτικού τρόπου δράσης της Ε2 αφού παράλληλα το cocktail επαναφέρει την υπεροξείδωση των λιπιδίων στα φυσιολογικά επίπεδα. Οι παρατηρήσεις αυτές προτείνουν την Ε2 ως μια μελλοντική υποψήφια φαρμακευτική αγωγή για νευροεκφυλιστικές καταστάσεις, όπως είναι η νόσος του Πάρκινσον, για τα θηλυκά βέβαια άτομα. Eπιπλέον προτείνουν ότι ο συνδυασμός της Ε2 και του NAC μπορεί να οδηγήσει σε εφαρμογή μικρότερων και κατά συνέπεια λιγότερο επιβαρυντικών, από άποψη παρενεργειών, δόσεων που θα οδηγεί σε ίδιο ή και μεγαλύτερο νευροπροστατευτικό αποτέλεσμα με τη μεμονωμένη χορήγηση της 17β-οιστραδιόλης.