Έκφραση του c - mos στον καρκίνο του πνεύμονα. Πρότυπα έκφρασης c - mos / p53 σε σχέση με τις κινητικές παραμέτρους

Abstract

The c-mos proto-oncogene is the cellular homologue of v-mos oncogene, a product of Moloney murine sarcoma virus, identified in early 1980’s. It is located at chromosome region 8q11-12 and encodes a Mr 39,000 protein with serine-threonine activity. C-mos is an upstream activator of the MAPK pathway, a phosphorylating MAPK kinase. It plays an important role in oocyte maturation in which, as a component of the cytostatic factor, it arrests oocytes at metaphase II by stabilizing the maturation promoting factor. Furthermore, c-mos activity is associated with the appropriate formation and orientation of the meiotic spindle that leads to asymmetric division of the oocyte and the production of the first polar body. Although the role of c-mos in oocyte maturation is well established, very little is known about its expression and functions in human somatic cells. Constitutive expression of c-mos in somatic cells, such as mouse fibroblasts, induces oncogenic transformation. There is strong evidence that the transformation activity of c-mos, like many other oncogene products, is exerted when it is expressed in the G1 phase. Based on the work of Fukasawa and Vande Woude which states that c-mos overexpression via MAPK/ERK pathway causes inhibition of the cell cycle or apoptosis, this study is an attempt to clarify the interaction between c-mos and p53 expression. For the purposes of this study the saos /p53 tet-on system was used. The saos cell line is p53 null and its expression is fully restored by the addition of tetracycline, which increases the apoptosis rate dramatically. Transiently transfecting these cells with c-mos results in a great decrease in apoptosis regardless of the presence or absence of p53. This shows that somehow the presence of c-mos inhibits apoptosis irrespective of whether the levels of DNA damage is high or whether the corresponding surveillance mechanisms are activated. Since the Saos cell line carries a high level of endogenous DNA damage especially double strand breaks, it was thought necessary to use the U2OS cells line. In these cells p53 is intact and the levels of DNA damage are much lower. Two new stable cell lines were constructed, U2OS-mos and U2OS-mock. These cells were initially irradiated with Ionizing Radiation of 3, 6 and 9 Gy and then the apoptosis was measured by flow cytometry. The FACS analysis showed an important reduction of apoptosis in the mos cell line compared to control cells line. It was hypothesized that since the U2OS cells have wild type p53, the addition of taxol or nocodazole (genotoxic stress), would result in the further activation of G1 checkpoint and the inhibition of the cell cycle, resulting in senescence. Ten days after the U2OS-mos cells had exited mitosis, they indeed started to show senescent phenotype and were also positive using the β-galactosidase staining. In order to further investigate the role of c-mos in human cells, this study was expanded to human primary cell lines (IMR90 and MRC5), which were stably transfected with c-mos using retrovirus. It is noteworthy that the cells transfected with c-mos often obtained senescent phenotype. Thus, introducing c-mos in normal cellular systems results in the firing of two major anti-cancer mechanisms, apoptosis and senescence.

Το πρωτο-ογκογονίδιο c-mos είναι το κυτταρικό ανάλογο του ν-mos ογκογονιδίου, προϊόντος του ιού MMSV (Moloney murine sarcoma virus) που ταυτοποιήθηκε στις αρχές της δεκαετίας του ’80. Εντοπίζεται στη χρωμοσωμική περιοχή 8q11-12 και κωδικοποιεί για μια πρωτεΐνη 39 kDa με δραστικότητα κινάσης σερίνης-θρεονίνης. Το c-mos ενεργοποιεί την οδό των ΜΑΡΚ, φωσφορυλιώνοντας την κινάση των ΜΑΡΚ (ΜΑΡΚΚ). Παίζει σημαντικό ρόλο στην ωρίμανση των ωοκυττάρων, κατά την οποία, ως συστατικό του κυτταροστατικού παράγοντα (cytostatic factor, CSF), αναστέλλει την πρόοδο των ωοκυττάρων στη μετάφαση II σταθεροποιώντας τον παράγοντα προαγωγής της ωρίμανσης (Maturation Promoting Factor, MPF). Επιπλέον, η δραστικότητα του c-mos συνδέεται με τον κατάλληλο σχηματισμό και προσανατολισμό της μειωτικής ατράκτου και στην επακόλουθη ασύμμετρη διαίρεση του ωοκυττάρου και την παραγωγή του πρώτου πολικού σωματίου. Παρόλο που ο ρόλος του c-mos στην ωρίμανση των ωοκυττάρων είναι γνωστός, πολύ λίγα είναι γνωστά για την έκφρασή του και τις λειτουργίες του στα ανθρώπινα σωματικά κύτταρα. Συνεχής (constitutive) έκφραση του c-mos σε σωματικά κύτταρα, όπως σε ινοβλάστες ποντικιού, επάγει τον καρκινικό μετασχηματισμό. Υπάρχουν ισχυρά στοιχεία ότι η μετασχηματιστική δράση του c- mos, όπως πολλών άλλων προϊόντων ογκογονιδίων, ασκείται όταν εκφράζεται στην G1 φάση. Βασιζόμενη στη μελέτη των Fukasawa και Vande Woude, η οποία ανέφερε ότι η υπερέκφραση του mos μέσω του MAPK/ERK μονοπατιού προκαλεί αναστολή του κυτταρικού κύκλου ή απόπτωση, η οποία είναι p53-εξαρτώμενη, η παρούσα μελέτη προσπάθησε να διερευνήσει τη σχέση μεταξύ έκφρασης του mos και της p53. Για το λόγο αυτό χρησιμοποιήθηκε η κυτταρική σειρά Saos με το επαγόμενο σύστημα τετρακυκλίνη. Στο συγκεκριμένο κυτταρικό σύστημα, στο οποίο το γονίδιο p53 έχει ομόζυγα απαλειφθεί, η αποκατάσταση της έκφρασης της p53, με την προσθήκη τετρακυκλίνης, αυξάνει δραματικά τα επίπεδα κυτταρικού θανάτου. Παρόλα αυτά, η εισαγωγή του ογκογονιδίου c-mos και η απότοκος έκφραση του αντίστοιχου προϊόντος επέδειξε σημαντική μείωση στα επίπεδα του κυτταρικού θανάτου συγκριτικά με τα συστήματα αναφοράς, ανεξαρτήτως της έκφρασης ή μη της p53. Το αποτέλεσμα αυτό υποδηλώνει, ότι με κάποιο μηχανισμό η ύπαρξη του mos έχει τη δυνατότητα να καταστέλλει την απόπτωση, ασχέτως αν τα επίπεδα αλλοιώσεων του DNA είναι υψηλά και ανεξαρτήτως του αν οι αντίστοιχοι μηχανισμοί επιτήρησης και προστασίας του γενώματος είναι ενεργοί. Εφόσον η πατρική κυτταρική σειρά Saos αποτελεί σύστημα υψηλού επιπέδου ενδογενών αλλοιώσεων του DNA και κυριότερα του τύπου των δικλωνικών θραύσεων, θεωρήθηκε σκόπιμο να χρησιμοποιηθεί η κυτταρική σειρά U20S, που φέρει χαμηλά επίπεδα ενδογενών αλλοιώσεων DNA. Το συγκεκριμένο κυτταρικό σύστημα φέρει ακέραιη p53. Στις δυο νέες κυτταρικές σειρές που προέκυψαν, στην U2OS-mos και στην U2OS-mock αρχικά ασκήθηκε γενοτοξική προσβολή με την εφαρμογή ιοντίζουσας ακτινοβολίας σε ένταση 3, 6 και 9 Gy και ακολούθως εκτιμήθηκαν τα επίπεδα απόπτωσης. Παρατηρήθηκε, ότι η έκφραση mos σχετιζόταν χαρακτηριστικά με σημαντικά μειωμένη απόπτωση. Υποτέθηκε, πως τα U20S κύτταρα, εφόσον φέρουν ακέραιη p53 πρωτεΐνη, θα εκδήλωναν μετέπειτα ενεργοποίηση του σημείου ελέγχου G1 και αναστολή του κυτταρικού κύκλου μετά τη γενοτοξική επίδραση της ταξόλης ή νοκοδαζόλης, με αποτέλεσμα να οδηγηθούν στην απόκτηση φαινοτύπου γήρανσης. Πράγματι, δέκα μέρες μετά την έξοδο από τη μίτωση τα επιβιώσαντα mos-θετικά κύτταρα είχαν στην συντριπτική τους πλειοψηφία αποκτήσει αξιοσημείωτα μεγάλο μέγεθος, σχήμα αποπλατυσμένο και εκδήλωναν ισχυρά θετική αντίδραση β-γαλακτοσιδάσης σε pH 6, που θεωρείται βιβλιογραφικά ως παθογνωμονικός δείκτης κυτταρικής γήρανσης. Προκειμένου να διερευνηθεί περισσότερο η δράση του mos στα ανθρώπινα κύτταρα, η μελέτη επεκτάθηκε σε κυτταρικά συστήματα ανθρώπινων πρωτογενών ινοβλαστών (IMR90 και MRC5), στους οποίους το mos εισήχθη με διαμόλυνση μέσω ρετροϊών. Αξιοσημείωτο ήταν το γεγονός, ότι τα κύτταρα, που δέχτηκαν το mos, συχνά αποκτούσαν φαινότυπο γιγαντιαίου κυττάρου ενώ σε σημαντικό ποσοστό διέφεραν από τα κύτταρα ελέγχου στο γεγονός ότι εκδήλωναν μεγαλύτερα ποσοστά κυτταρικού θανάτου και παράλληλα όσα ζούσαν εκδήλωναν θετικότητα για τη χρώση β-γαλακτοσιδάσης, που καταδεικνύει κυτταρική γήρανση. Συνεπώς η είσοδος του mos σε ακέραια φυσιολογικά κυτταρικά συστήματα είναι ικανή να πυροδοτήσει τους δυο κυρίαρχους αντικαρκινικούς μηχανισμούς, την απόπτωση και την κυτταρική γήρανση.